リアルタイムで中皮細胞の卵巣癌スフェロイドアタッチメントおよび浸潤の評価

卵巣癌は、婦人科の癌のすべての¹の最も高い死亡率を有する。世界的に、〜23万例や疾患による10万人以上の死亡者は毎年^1があります。癌が既に転移した後の治療は、化学療法に対する耐性の増加によってさらに複雑であり、予後は²悪い場合ほとんどの患者（> 75％）は、診断されている。ステージIII〜IVの転移性疾患の患者だけ30から40パーセント³の5年生存率を持っている。従って、効果的に進行した疾患を治療するために、卵巣癌転移の基礎となる細胞挙動のより良い理解のために緊急の必要性がある。

卵巣癌転移の現在のモデルは、腫瘍の行動への影響の異なる微小環境で発生し、その各々の転移過程でいくつかのステップを提案する。転移性卵巣癌細胞が最初に原発腫瘍部位から脱落し、nonadherで生き残るされる単一細胞または三次元多細胞構造のような腹膜液内のENT状態は、多細胞凝集体またはスフェロイド^2,4,5と称される。懸濁液中のスフェロイドを形成しない細胞がアノイキス^2,4,5の影響を受けやすくなります。スフェロイドも残存病変やがん^2,4,5のその後の再発に貢献し、化学療法への抵抗の増加を示す。卵巣癌転移の第二の重要なステップは、腹膜壁と大網^5,6内で確立二次腫瘍に自由に浮遊クラスタから凝集体の遷移である。細胞-細胞および細胞-基質相互作用は凝集体の形成、生存および腹膜^4月11日の中皮ライニングによって生成細胞外マトリックス（ECM）への接着に関与している。まだ、これらのプロセスは、ほとんどわかっていない。

卵巣癌の普及に関与するメカニズムを定義するには、スフェロイドはGENERすることができますated培養培地^12,13にメチルセルロースを添加することによって、又は低付着性プレート^2,14上で細胞を培養することによりいずれかの懸濁液中の細胞を維持し、非接着性の培養方法を用いて確立された癌細胞株から。このようにして培養した場合に、卵巣癌細胞は、 インビボで見出さ^2,14腫瘍の凝集体と同様、細胞、分子および生化学的特性を示す多細胞凝集体またはスフェロイドへと集合する。形成された後、回転楕円体は、その後非付着性培地から収穫することができ、更なる機能的研究のための種々の固体表面上に再播種し。これは正確な腹腔内液のような非接着性の環境内転移性卵巣癌細胞の挙動をモデル化していない単層培養でのアッセイ、以上の進歩を表す。

癌スフェロイドの侵入能力は、ボイデンチャンバー²内の伝統的なエンドポイントアッセイで評価することができる15,16に侵入することにより、中皮細胞クリアランスのタイムラプスビデオ顕微鏡を用いてなされたものであり;しかしながら、時間経過のデータの分析は時間がかかり、主観的であることができる。ここで、実時間における卵巣癌スフェロイドの侵襲的挙動を評価するための迅速で定量的な方法が記載されている。まず、回転楕円体、中皮細胞モデルは、多細胞スフェロイドに接続し、二次腫瘍を形成するために、腹膜ライニングに侵入する際、卵巣がんの転移の段階を表す設立されました。次いで、リアルタイムセルアナライザー（RTCA、会社の詳細については材料の表を参照）のための方法論は、スフェロイドとして増殖させ、異なる卵巣癌細胞株の浸潤能の定量的リアルタイム測定を実施するように適合され、このモデルにおいて試験した。

RTCA中でのインストゥルメント、細胞応答は、電気インピーダンスの変化を測定することによって、外因性の標識を必要とせずに、アッセイの過程にわたって連続的に監視される。特別に設計された培養プレートを2ウェルチャンバー（「CIM」プレート）の上部及び下部チャンバーの間の界面で微多孔膜の下に位置する金被覆の微小電極を有する。細胞は、ECMまたはECM /携帯障壁を侵入するように、下部チャンバー内の電極の位置は、電気インピーダンスの変化を測定することができる。各CIMプレートのウエルの2室間の膜界面は、まず、目的のECM成分でコーティングされている。スフェロイド中皮細胞モデル系において、インターフェースは、「ヒト中皮のコンフルエントな単層を、続いて、腹膜の中皮ライニングの根底にある複雑なECMを模倣するために、（会社の詳細については、材料表を参照）マトリゲルの層で被覆されているターゲット '細胞。最後に、予備形成された卵巣癌スフェロイドは広告ですDED。卵巣癌スフェロイド細胞が活発に下部チャンバーに到達し、電気インピーダンス測定値を変化させるために、標的細胞膜及びマトリックスを介して侵入しなければならない。自分で標的細胞はまた、それらがマトリックス層を通って侵入し、このアッセイにおいて使用するのに適していないことを保証するために評価される。

1。細胞、培地、および試薬の調製を

1. メチルセルロース含有培地の調製
   1. 250mlフラスコ中の滅菌ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（無添加）100mlに1.5gのメチルセルロースを溶解する。
   2. 5分間電子レンジで低い上に溶液を加熱し;吹きこぼれないように注意してください。
   3. メチルセルロース粉末が半溶解された後、125ミリリットルにボリュームを取るためにきれいな磁気攪拌機やメディアを追加します。
   4. ミックス、反転、および4℃で一晩撹拌し、1.5時間、室温で撹拌する。
   5. 2,300×gで均等に4 50mlチューブと1.5時間の遠心に溶液を分割します。
   6. 最大3ヶ月間、4℃で透明、高粘性の滅菌50mlチューブに上清（株式の約百分の90から95まで）、分量、店舗を収集します。
2. 文化や細胞の標識
   1. TIの中で単層での卵巣癌細胞株を維持する10％ウシ胎児血清（FBS）、2mMのLを補充した：37°C、（OVCA429とOVCA433細胞株¹⁸ M199 KGNセル¹⁷とMCBD110ためDMEM）適切な増殖培地中、5％CO ₂でssue培養インキュベーター-グルタミン、および1％ペニシリン - ストレプトマイシン。
   2. M199でLP9ヒト中皮細胞を維持する：ハムのF12培地、15％FBS、10 ng / mlの上皮成長因子（EGF）を含有し、400 ng / mlのヒドロコルチゾン、37℃、5％CO ₂インキュベーター中。
   3. 希望のフラスコの大きさの種細胞と約75％の集密度まで成長する。 0.05％トリプシン/ EDTA、5分間、186×gでスピンコートを用いてトリプシン処理により細胞を回収し、PBSで2回細胞ペレットを洗浄する。
   4. 血球計数器を用いて細胞を数える。
3. オプションの蛍光細胞標識法
   1. 予め温めたPBS/0.1％のBSAを1ml中、1×10 ⁶細胞/ mlの最終濃度で再懸濁し、癌細胞。
   2. 5 mMストックセルTrの2μl加えエースCSFE溶液（または長期に保持されている他の好ましい細胞ラベル）、10μMの最終濃度で細胞にし、水浴中で10〜15分間37℃でインキュベートする。
   3. 遠心分離により、10％FBSおよび再ペレットを含む氷冷培地1mlで反応をクエンチした。適切な予め温めた成長培地10mlに再懸濁する（ステップ1.2.1を参照）。
   4. 37℃、5％CO ₂で75cm ^2のフィルターでキャップされたフラスコ培養に種子細胞。
   5. 蛍光標識のレベルは検出のために適切であることを確認するために、蛍光顕微鏡下で細胞を確認してください。細胞は、約75％の密集度、収穫に達し、ステップ1.2.3および上記の1.2.4のように数えたら。

メチルセルロース中スフェロイドの2。世代

1. スフェロイドの生成に必要な第1の卵巣癌細胞の体積を計算し（300,000細胞の総数は、それぞれ完全な96ウェルプレート実験のために必要とされる）。いいえテ：ここで提示異なる細胞株を用いた場合、均一な球状体の生成のための細胞密度は、各ラインのために最適化される必要があり得る。
2. メチルセルロース培地中の細胞の希釈を計算するには、まず、15ミリリットルから（ステップ2.1）に必要な細胞量を減算する。
3. メチルセルロースの株式各細胞株の培養培地に適切な量の解（最終20％メチルセルロースにするために）、15ミリリットルに等しいマイナス細胞容積の3ミリリットルを加え、穏やかに反転させることによって十分に混和する。
4. メチルセルロースを含む培地に300,000細胞を加え、穏やかに反転させることによって十分に混合した。
5. 37℃で96ウェル凹の底培養プレートと文化の各ウェルに（3000細胞/ウェルの合計）セル/メチルセルロース/メディアミックスのピペット150μL、5％のCO ₂ 1-4日間か均一な球状体が形成されるまで（1回転楕円体/ウェルは、一般的に観察される）。

3。RTCAの細胞浸潤アッセイ

NOTE：インピーダンス測定値はセルインデックス（CI）、細胞状態を表す測定されたセルのインピーダンスの相対的な変化である無次元パラメータとして表現さ​​れる。 Microsoft Excelなどのスプレッドシートに分析のために、データをインポートし、。

1. プレートの準備
   1. 一度に4ウェルの基で働く、全表面積を覆うことを保証するために、16ウェルRTCA CIMプレートの上部チャンバーの各ウェルに50μlの基質（無血清培地中で1:10希釈）を追加。任意の余分な水分を取り除くために、ゆっくりと、すぐに行列の30μLを削除しますが、。
   2. 組織培養インキュベーターで使用する前に4時間、37℃でプレートをインキュベートする。
   3. 下部チャンバーに（あなたの実験計画どおり）は、血清の有無にかかわらず、上室に各がん細胞株に対して適切な無血清培地（SFM）を30μlとメディアの160を添加する。
   4. 上室とequilibrに下室をクリックして、CIMプレートを組み立てる組織培養インキュベーター中で1時間、37℃のインキュベーター中で食べた。
2. RTCAインストゥルメントのプログラミング
   1. RTCAを開き、「レイアウト」タブを選択します。すべての実験ウェルを強調表示します。
   2. 右ウェル上でクリックして、「井戸をオンにする」を選択します。必要に応じて、その後の実験条件およびセル名を入力します。
   3. プログラムにステップまたはサブステップを追加するには、「ステップを追加する「オン」スケジュール]タブを選択し、右クリックし。最初のステップは、「ステップを追加」を選択したら、自動的にプログラムに組み込まれている事前にプログラムされた背景スイープです。
   4. LP9単層の確立中に測定値を記録しますRTCAプログラムのステップ2のために、所望の番組の詳細を入力します。 」「間隔」タブを選択し、'15分を入力することにより、インピーダンスの測定値の間の時間間隔を追加します。 「期間」タブANを選択することで、実験期間を追加D 12から24時間の間の時間を入力する。
   5. その後の工程を追加するには、「ステップを追加し「オン」スケジュール]タブを選択し、右クリックし、上記のように、追加の手順の詳細を入力します。 RTCAプログラムのステップ3は、回転楕円体の侵略の際に読み取りを行うための道具を指示します。 「時間」タブの下に間隔」タブと'48時間 'の下に' '5分を入力します。
   6. メニューバーの「プレート」を選択し、保存します。
3. スフェロイド侵略のLP9単層および測定の生成
   1. 上記の手順3.2からRTCA機器とオープンプログラム中のCIMプレートを置きます。セルを追加する前に、メニューバーの「実行」した後、「スタート」を選択します。背景スイープは自動的に（RTCAソフトウェア命令のステップ1）が実行されます。
   2. 組織培養フードの背景スイープと場所次の機器からのCIMプレートを取り外します。
   3. プレート50,000 LP9細胞が各ウェルのCIMプレートの上部チャンバーに160μlのSFMに懸濁した。
   4. RTCAの機器にプレートを置き、LP9単層で一晩（RTCAプログラムのステップ2）を確立している間の測定値ごとに15分を取る。
   5. 上記の手順2の下で生成された収穫癌スフェロイド」メチルセルロース中スフェロイドの生成 '、。
      1. 無菌的に、1ミリリットルピペットチップの上から1ミリメートルをカットし、静かに、各ウェルの内容を取得するために使用する。滅菌チューブに移します_。
      2. 遠心分離機は、8分間120×gで回転楕円体、そし​​て穏やかな吸引によりメチルセルロースを含む培地を除去します。
      3. 各洗浄後スフェロイドをペレットに8分間120×gで遠心分離し、PBSで2回以上のスフェロイドを洗ってください。
      4. 各実験ウェルについて、FBSを含まない培地を160μlの10スフェロイドの合計を懸濁します。
      5. メニューバーから「実行」を選択し、チェック＆によってRTCA実験を一時停止＃8216; '一時停止します。測定器からのCIMプレートを取り外し、組織培養フード内に配置します。を吸引し、各ウェルからの培地を切り、LP9のみのコントロールウェルのための回転楕円体含有培地（160μL中10球）や新鮮な培地と交換してください。
   6. RTCA機器にプレートを返します。メニューバーから「実行」と「ステップの中止」にチェックを選択します。プログラムは自動的に次のステップに移動します。実験を再開するには、メニューバーから「実行」と「スタート/続行」をチェック]を選択します。 RTCAプログラムステップ3が開始されます。
4. データ解析
   1. 回転楕円体の細胞浸潤性のレベルを決定するために、唯一の各時点で卵巣癌細胞株について得られた個々の測定値からLP9単層について得られた値を減算します。
   2. 「回転楕円体の侵入を 'プロットするには、sが、スフェロイドをプレートに添加した時点までのすべての値を正規化する'0 'にその時点をetting。

卵巣癌スフェロイドは、懸濁液中または悪性腹水^2,14からの原発性腫瘍細胞を採取することによって、それらを培養することにより細胞株の多くのタイプから生成することができる。ここでは、2つの上皮性卵巣癌細胞株OVCA433とOVCA429、および卵巣顆粒膜細胞腫瘍株、KGNは、回転楕円体（ 図1A）を生成するために使用されている。メチルセルロースの添加により粘性なされた培地中に懸濁しながら、この方法では、細胞をU底ウェル中で培養される。これらの条件下では、多くの卵巣癌細胞スフェロイド^13を形成するために凝集する固有の能力を示す。メチルセルロース/培地に懸濁し、一晩培養後、3つ全ての細胞株は、直径が約400-500ミクロン（ 図1A）のコンパクトな回転楕円体構造を形成した。一方、RTCA CIMプレートは、まずマトリックス及びヒトのMES次いで、コンフルエントな単層を有する多孔質膜界面をコーティングすることにより、調製されるothelial細胞（ 図1B）。一旦形成されると、球状体は、その後、準備されたCIMプレートに移す。収穫癌スフェロイドはLP9単層の頂部上に播種し、下記のように評価される。並行培養の標準的な位相差顕微鏡下の画像（または蛍光顕微鏡下で、オプションの細胞標識ステップが続いていた場合）は、RTCAデータ（ 図1C）の解釈を支援するために、定期的に行われている。

これは、癌細胞株の浸潤の基礎レベル、ならびに化学誘引物質誘発性浸潤の両方を評価するために有益である。典型的には、基底侵襲性の両方上部及び下部チャンバーにSFMを添加することによって測定される。多くの潜在的な化学誘引物質を含有する完全培地（10％FBS）は、「化学誘引物質誘発'浸潤（ 図2）を調べるために、現在の例で使用されている。単独LP9中皮細胞の平行研究は、これらの細胞が最小限であることが確認され基礎又は「化学誘引物質」誘導条件下のいずれかで2日間vasive、したがって卵巣癌細胞（ 図2Aおよび2B）と共培養アッセイにおいて使用するための良好な細胞型であった。対照的に、3つの細胞株のいずれかを用いて生成された卵巣癌スフェロイドは化学誘引物質（FBS）（ 図2A〜2C）に向かって侵入する能力を示した。伝統的なエンドポイントアッセイを介しRTCAリアルタイム器具を使用することの主な利点は、細胞/スフェロイド挙動の変化を経時的に定量することができることである。 2日間のアッセイにわたって、KGN、OVCA429、OVCA433および細胞株はすべて、（セルインデックスを増加させることによって示される）化学誘引なく、浸潤の低い基礎レベル（ 図2C）に向かって侵入する能力を示した。曲線（ 図2C）の平行な斜面によって示されるように、細胞株は、浸潤の類似率を示し;しかし、OVCA429曲線が高く、上の漸近線を示し、これは、他の細胞株と比較して侵入の最大レベルより高いことを示した。さらに、細胞株は、KGN細胞が迅速に（ 図2D）は、それぞれ、侵略するより長い3 - 5回取り、細胞およびマトリックスの障壁とOVCA433とOVCA429細胞に侵入して、侵入の発症への時間の差を示した。重要なのは、侵略の開始時に、その行動は侵略のための彼らの全体の容量（ 図2Cおよび2D）の予測ではなかった。これは、癌細胞株の異なる固有の能力を示唆しているだけでなく、別の要因はスフェロイドの初期および後期浸潤性挙動を調節し得ることを示すことができる。

図1実験のスフェロイド世代モデルは、Aを設定します。私予め形成された模式RTCA 2を示すことは、CIMプレートがうまくセットアップチャンバー、卵巣がん：メチルセルロース/メディア（ 上 ）にして単層（ 下 ）として成長一致する細胞株の形成スフェロイドの位相差顕微鏡下メイジB。スフェロイドは、化学誘引物質としてFBS±上部チャンバーと培地中のLP9の中皮層/マトリックスバリアの単層の上にメッキされ、下部チャンバーに加える。より多くの細胞が下室への障壁を侵入するなどの電気インピーダンスを高める2室対策のインタフェースの下に電極C：位相差顕微鏡（ 左 ）や蛍光顕微鏡（ 右 ）の下LP9単層の上にKGNスフェロイドのイメージ。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2リアルタイム卵巣癌スフェロイド侵略データA - B：RTCA浸潤アッセイの代表的な結果はよく、CIMプレートの底チャンバーにFBSをしてなくても実施しました。 KGN細胞浸潤はLP9中皮細胞と比較される。結果は、24時間の時点（A）で、全体の2日間のアッセイ期間（B）の上に三連ウェルから平均±SDセルインデックスとして表示され、C - D：KGN、OVCA429の浸潤能の比較、OVCA433細胞24時間の期間（C）を越えて2.5時間の期間（D）をより詳細な形で示されているライン。

侵入卵巣癌細胞は、線維芽細胞、脂肪細胞及び中皮細胞を含む、腹膜の表面に種々の細胞型と相互作用し、癌細胞と腹腔細胞との間の双方向通信は、転移プロセス^2を駆動する際に重要な役割を果たしていると考えられている。一度習得し、本明細書に記載されるプロトコルは、腹膜微小環境内のこれらの相互作用の研究に容易に適応可能である、 例えば 、外因性のサイトカイン、成長因子、またはCIMウェルプレート又は遺伝子操作の上側または下側のチャンバーに特異的阻害剤の添加を介して腹膜癌または細胞株の。さらに、この方法は、腹腔内の転移性病変の確立を支配する調節シグナルおよび細胞間相互作用に直接洞察を得るために、悪性腹水および/または原発性腹膜細胞から新たに採取した原発性卵巣腫瘍細胞を使用することができる

単一細胞またはスフェロイドの浸潤能を測定するためのRTCA機器を使用することにより、従来の単一のエンドポイントアッセイおよびタイムラプス画像解析に比べていくつかの利点を提供しています。 RTCA機器は、数時間または数日間ことができるアッセイの過程にわたって連続して定義された間隔で細胞浸潤を測定します。これは、単一のエンドポイントアッセイの限界を克服し、経時的浸潤率の変化の決定を可能にする。例えば、単一のエンドポイント（ 図2）での異なる癌細胞株からの侵略データなどを調べて 、3時間後には、KGNとOVCA433細胞がOVCA429細胞よりもはるかに侵襲的だった、誤った結論につながっている可能性があります。この技術の別の利点は、RTCA器具は電気インピーダンスの変化を測定することである。これは、アッセイは、細胞フェンに対する意図しない影響を与える可能性があり、外因性の薬剤で細胞を標識することなく実行することができることを意味OTYPEまたは関数。それはそれらのインビボ性質上²の反射ではない分子および表現型変化を導入することを避けるように最小限に操作を維持することが不可欠であるとの悪性腹水から誘導された原発性卵巣癌細胞を研究する場合に特に重要になります。さらに、RTC​​A機器の使用は、タイムラプス顕微鏡検査に関連した分析を消費する時間を回避するが、アッセイの最適化のための重要な実験のWindowsの迅速な決定を可能にするだけでなく、リアルタイムで定量的なデータの収集を可能にします。スフェロイド浸潤に対する因子の範囲の効果を比較する際の異なる要因が経時的に異なる時点で、または大幅に異なるプロファイルでその最大の効果を発揮し得るので、これは特に有用である。

このプロトコルは、変更が（ 例えば 、異なるECM行列、異なる癌細胞株、または異なるターゲットセルの使用に適しているものの、そうする場合のls）、様々な実験条件は最初に最適化しなければならないことに留意することが重要である。例えば、回転楕円体侵入の研究を開始する前に、癌細胞/ CIMプレートの最適数は、ウェルまず、単層培養中の細胞数滴定のアッセイによって決定されるべきである。ウェルあたりに使用するスフェロイドの最適数は、この分析に基づいている。最初に生成するとき、例えば、現在の方法では、スフェロイドは、約3,000個の細胞をそれぞれ含む。初期の細胞数滴定が単層中の30,000細胞を分析し、侵入での検出に最適であることを示している場合には、10スフェロイドがよく、CIMプレート当たりに添加されています。共培養実験を行うときは、この結果を混乱させる可能性があるのでさらに、それは、これらの細胞は、本質的に侵襲的であるかどうかを決定するために、別々に「標的」細胞単層の挙動を研究することが重要である。実証例では、癌スフェロイドLP9細胞monolaの上にメッキされるFBSとないヤーは、化学誘引物質としてだけでなく下部に追加。並行して、LP9細胞は、それぞれの処理条件の下で、単独で培養される。

細胞スフェロイドの浸潤能を検討する場合も同様に、それは2つの動作を区別するために、同様に彼らの回遊能力を検討することも重要です（移行はしませんがすなわち侵略は、ECMバリアのタンパク質分解が必要）。これを行うには、ECM関門（ステップ3.1.1 - 3.1.3）を省略し、所定の位置に、ECM障壁と並行して分析を行っています。所望であれば、後者の「侵入」の尺度は、前者の「マイグレーション」の小節に補正することができる。細胞を、底部チャンバ内に侵入した後、それらの付着、拡散、膜の下側増殖の変化は、変化に寄与することができる：最後に、電気インピーダンスの測定値から得られた情報が、範囲が限定されていることに留意することが重要でインピーダンスREAへこみ。スフェロイド包括的に細胞挙動を評価するために、スフェロイド細胞生存率、接着、遊走、および形態の他のアッセイと組み合わせて使用​​するため、この方法が最も有益である。スフェロイドの形態学及び健康の定性的評価は、浸潤の定量的RTCAアッセイと並行して行うことができるように、例えば、理想的には、完全にスフェロイド中皮相互作用を理解するために、別個の共培養物はまた、標準的な位相差顕微鏡下で定期的に画像化されるべきである。任意のラベリングステップが実行される場合、それらは回転楕円体から脱凝集および非標識中皮細胞と相互作用するように、単一の癌細胞の挙動は、蛍光顕微鏡下で測定することができる。第二の細胞型と共培養するとき、蛍光癌細胞を標識するという付加的な利点は、それが癌細胞のみが細胞とECMの障壁を通って侵入したことを確認することが可能であるということである。