ルシフェラーゼ活性を介し受容体活性化の測定：哺乳類嗅覚受容体のハイスループット分析

哺乳類の嗅覚系は、匂い物質の何千もの検出および識別を可能にし、臭気刺激の膨大な数に応答する能力を持っています。嗅覚受容体（ORS）は、嗅上皮¹²内の嗅細胞によって発現される分子センサーである。哺乳類の匂い認識は匂い物質によるORの差動活性化を介して発生し、または遺伝子ファミリーは、およそ千マウスおよび400ヒト受容体^12月16日に、広範囲に及ぶ。嗅覚ニューロンにおける異種細胞でのORの前の機能解析は、さまざまな匂い物質がユニークで認識されていることを示しますが、論理和^10,17-20のアンサンブルを重ねてきた。論理和にリガンドを一致させることは嗅覚コードと嗅覚の生のモデルを構築するための不可欠なを理解するために重要です。により、異種システムでの論理和だけでなく、匂い物質と論理和の両方の多数を表現する難しさに、このデータは、Fからのほとんど存在しているield;確かに、人間の論理和未満の6％は、公表リガンド^1月11日を持っている。このプロトコルは、付臭剤/ ORの相互作用を特徴づけるルシフェラーゼアッセイの使用が記載されている。このアッセイは、ORのハイスループット特性評価、匂い物質/ ORの相互作用を理解するだけでなく、臭い符号化のモデルを開発するために不可欠であるタスクを可能にします。

ORのハイスループット研究は、三つの主要な課題に直面している。まず、オッズ比は、ERに保持され、その後、プロテアソーム^21,22で分解、アッセイ系^23〜25内の臭気物質と相互作用するのORを防止し、異種細胞で発現。この問題は、論理和^19,26,27の広範囲の安定な細胞表面発現を容易にするアクセサリータンパク質の発見によって対処した。受容体-トランスポータータンパク質1および2（RTP1および2）を促進OR刺激臭剤¹⁹に応答して細胞表面発現および活性化。この研究に基づいて、HEK293T細胞であった安定にHana3A細胞株^19,27、その結果、長いRTP1（RTP1L）およびRTP2、受容体発現促進タンパク質1、およびGの_αolfを発現するように改変された。また、タイプ3ムスカリン性アセチルコリン受容体（M3-R）は、細胞表面での論理和と相互作用し、臭気物質²⁶に反応して活性化を増強する。堅牢でのHana3A細胞の結果にRTP1SとのORとM3-Rの同時トランスフェクション、一貫性があり、細胞表面²⁷でのORの広い範囲の機能的発現。第二に、哺乳類又はレパートリーは非常に大きいです。ヒトでは、例えば、和レパートリーは味覚受容体のレパートリーを超える数々の桁であり、視覚的な受容体のレパートリーを超える数々の2桁。比較的簡単なプロトコルで、単一またはあるのクローンを作成するが、有意なアップフロントの努力は、包括的なライブラリを生成する必要がある。我々は幻の中で、波長は色に変換されることを知っているが、第3、第オーディション周波数がピッチに変換で、臭気の組織はあまりそれが困難な研究者が、臭気物質の代表的なサンプルから補間できるようにすること、理解されている。いくつかの進歩がこのフロント^10,28について説明したが、嗅覚風景のマップが不完全なままになります。 ORの数百万の分子に対して、数千の物をスクリーニングすることは困難な作業です。このドメイン内のハイスループットスクリーニングは、慎重に定義のキャンペーンを必要とする。主要な残された課題は、物流とコストではなく、技術に固有の問題点のものです。異種スクリーニングが広く学術基によってリガンドを同定するために使用されていないが、民間企業が100ヒト論理和²⁹に対するリガンドを同定するために同じ技術を使用した。残念ながら、これらのデータは、独自のまま。

ここで概説するハイスループットルシフェラーゼアッセイは、評価OR活性化するために使用される代替方法を超えるいくつかの利点を有する。責任もののネイティブ嗅細胞のSESは電気生理学およびカルシウムイメージングを用いて測定された、これらの技術は、困難なため、嗅覚ニューロンの応答特性の重複にニューロンの応答につながるまたは離れてからかっています。 、GFP標識受容体タイプ^30,31にノック^32,33嗅覚ニューロンをネズミアデノ経由で特定の受容体を提供するか^{、17,24,33は}単一の受容体の種類に録音をリンクすることができます録音した後、RT-PCRを行うこと、これらの方法ではあるが低スループットと大規模スクリーニングには適していません。異種スクリーニングシステムは、よりスケーラブルであり、2つの主要な形態は、文献で発見されています。cAMP経路の記者やイノシトール三リン酸（IP3）経路の記者。匂い刺激すると、オッズ比は、サイクリックAMP（cAMP）の¹²の産生をもたらすシグナル伝達カスケードの_Gαolf伝達を活性化する。交流の制御下にホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を共トランスフェクトすることによりAMP応答エレメント（CRE）、ルシフェラーゼ産生の定量化は、OR活性化を可能にする、匂い応答の関数として測定することができる。または活性化はまた_、Gα15/16またはGの_α15-OLFキメラ^24,25,34などのGタンパク質を共発現によりIP3経路にリンクすることができます。我々は3つの要因に基づいてここで紹介するアッセイを選択している：（1）Rhoのタグを付けた嗅覚受容体とRTP1の共発現は、細胞表面^19,27の嗅覚受容体の発現が向上します。 （2）のcAMP応答性レポーター遺伝子の使用は、測定OR標準的なセカンドメッセンジャー経路を介した活性化を可能にする;および（3）アッセイは、ハイスループットスクリーニングに適している。

このハイスループットルシフェラーゼアッセイは、嗅覚の分野に貴重な様々な研究にも適用可能である。まず、論理和をとり、多数の種のための受容体活性化パターンを決定するために、単一臭気物質に対してスクリーニングすることができるecific匂い物質。このタイプの研究は、またはステロイド嗅覚アンドロステ⁸への対応を担当するようにOR7D4を同定した。逆に、あるORは、受容体応答プロファイル^10を決定するために、臭気物質のパネルに対してスクリーニングすることができる。候補嗅覚着臭剤/ OR対は、これらの画面を介して確認された場合、相互作用は、臭気物質の濃度の増加にORの応答を検査する用量反応実験を行うことによって確認することができる。用量応答曲線はまた、進化の種および因果的突然変異を横切る受容体の進化の検査を可能にする、ORの変動は、インビトロ臭剤応答^8,9,11,35 に影響し、これらの研究は種間OR変動に拡張することができる方法を評価することができる遺伝^36,37は 、最終的に、このアッセイは、既知の着臭剤/受容体対^38,39のために拮抗OR特定の臭気物質に応答することができる匂いのアンタゴニストをスクリーニングするために使用することができる。要約すると、これは、高スループットルシフェラーゼアッセイを特徴付ける助けるOR活性化パターン及び嗅覚系における臭気符号化のより良い理解を提供する研究の範囲に適用可能である。