L'utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l'évaluation des réponses des cellules T<em> In vivo</em

Lymphocytes T jouent un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative et sont souvent la cible de la manipulation dans l'immunothérapie. Cellules CD4 ⁺ T effecteurs répondent à un antigène étranger en sécrétant des cytokines qui régulent de nombreux aspects de l'immunité et peuvent aussi aider directement les cellules B à fabriquer des anticorps. Cellules T cytotoxiques CD8 ⁺ (CTL) peuvent également répondre à un antigène étranger en sécrétant des cytokines ainsi que de jouer un rôle central à tuer directement les cellules exprimant un antigène étranger. L'interaction fondamentale qui initie ces fonctions effectrices des cellules T implique l'interaction du récepteur de lymphocyte T (TCR) avec des peptides étrangers présentés sur les molécules du CMH à la surface des cellules. Cellules T CD4 ⁺ reconnaissent peptides présentés sur les molécules du CMH de classe II sur les cellules présentatrices de l'antigène et des cellules T CD8 ⁺ reconnaissent peptides présentés sur les molécules du CMH de classe I qui sont habituellement affichées sur les cellules microbiennes infectés.

Pourafin d'évaluer le rôle des cellules T jouent dans une réponse immunitaire, il est indispensable que leurs fonctions effectrices sont mesurées par des techniques fiables et sensibles. Des méthodes communes pour l'évaluation de la réponse T cellulaire comprennent; CMH class-I/II/peptide tétramère réactivité; la production de cytokine par ELISPOT et coloration des cytokines intracellulaires; et tuant capacité ^{de 51} Cr-tests de libération. Ces tests, cependant, sont généralement effectuées ex vivo avec une stimulation in vitro, ou donnent un aperçu limité dans la fonction des cellules T. Idéalement, lorsque l'on mesure les réponses des cellules T, il serait bénéfique pour les évaluer in situ, in vivo, car ils se produisent, sans aucune manipulation de cellules T de manière à éviter des changements dans les paramètres de fonctionnement qui peuvent se produire par la stimulation in vitro. Parmi les plus couramment utilisés in vivo de cellules T des tests fonctionnels sont basées sur la mesure de meurtre CTL médiée par les cellules cibles marquées avec des peptides du CMH de classe I-contraignantes, qui sont énumérés in vivovia leur détection par marquage fluorescent avec des colorants vitaux tels que CFSE. Bien que ces types d'essais peuvent surveiller meurtre CTL médiation de cibles quand ils se produisent in vivo, ils ont déjà eu une capacité relativement limitée pour évaluer assassinat de cibles multiples présentant différentes concentrations et différents types d'épitopes peptidiques, qui est nécessaire pour permettre paramètres qualitatifs tels avidité fonctionnelle et comme variante de l'épitope de réactivité croisée à évaluer. Ces essais ne fournissent pas d'informations sur les réponses à médiation cellulaire T CD4 ^+.

Pour surmonter bon nombre des difficultés avec les méthodes actuelles utilisées pour évaluer les réponses des lymphocytes T, nous avons récemment mis au point un test multiplex sur la base de tableaux fluorescentes cibles (ALE), qui permet le suivi des réponses des lymphocytes T contre> 250 cellules cibles simultanément dans un animal par la cytométrie de flux ^{1, 2.} ALE sont constitués de lymphocytes marqués par sevconcentrations et combinaisons sieurs de colorants vitaux comme CFSE, CTV et DPC permettant> 250 groupes de cellules de fluorescence unique à être générés. Étant donné que ces cellules restent viables et totalement fonctionnel, elles peuvent être injectées dans des animaux pour permettre la surveillance de leur interaction avec les cellules in vivo ³ T effectrices. Par exemple, les agrégats de cellules ALE peuvent être puisées avec des peptides de classe I du CMH de liaison pour permettre une évaluation de la mise à mort médiée par des CTL spécifiques de l'antigène des cellules cibles ^1. En outre, les agrégats de cellules d'ALE peut également être puisées avec des peptides du CMH de classe II se liant, ce qui permet l'évaluation de spécifique cellulaire de l'antigène T auxiliaire (T _H) de l'activité par l'évaluation de l'activation (par évaluation des marqueurs d'activation tels que CD69, CD44 et / ou CD62L) des cellules B dans l'ALE portant peptide apparenté ^2. Depuis plus de 250 cibles peuvent être détectés simultanément, il est possible de mesurer de CTL et T _H réponses contre de nombreux amas de cellules cibles puisées avec npeptides ombreux à différentes concentrations et l'inclusion de nombreux répétitions. Le test FTA fournit donc un niveau de T effecteur cellulaire évaluation de la réponse in vivo sans précédent.

Ici, nous décrivons en détail la construction d'un ALE et montrons comment ils peuvent être appliqués à l'évaluation des réponses des lymphocytes T in vivo. Le mode opératoire décrit la construction d'un FTA composé de 252 groupes de cellules discernables par l'utilisation de trois colorants vitaux, composés de six répétitions de 42 groupes de cellules puisées avec des peptides de liaison II-CMH de classe I et. L'étiquetage des 42 groupes de cellules se produit dans 10 ml conique à fond des tubes et il est utile de prévoir ceux-ci dans un porte-tube, comme décrit dans le Tableau 1. Cette méthode peut être ajustée pour un plus petit nombre de grappes discernables au besoin, en réduisant la quantité d'étiquetage de chaque colorant a effectué ^1.

Nous soulignons l'utilité de l'analyse en montrant comment il peut mesurer responsabes générés par la vaccination poxvirus recombinant contre plusieurs épitopes dans une petite cohorte de souris. Ceci montre comment le dosage ALE peut être utilisée pour mesurer les réponses cumulatives et avidité fonctionnelle par le biais, respectivement, l'utilisation de l'aire sous la courbe (AUC) et les évaluations mesure de la concentration de peptide efficace nécessaire pour générer des réponses maximales moitié (CE _50).