Vi beskriver en fremgangsmåte for indusering av nøytrofil lungebetennelse ved utfordring for aerosoli lipopolysakkarid ved forstøvning, for å modellere akutt lungeskade. I tillegg er basis kirurgiske teknikker for isolering lunge, trakeal intubasjon og bronkoalveolar lavage også beskrevet.
Akutt skade lunge (ALI) er en alvorlig sykdom som kjennetegnes ved alveolar neutrofili, med begrenset behandlingstilbud og høy dødelighet. Eksperimentelle modeller av ALI er nøkkelen i å forbedre vår forståelse av sykdom patogenesen. Lipopolysakkarid (LPS) avledet fra gram-positive bakterier induserer nøytrofil inflammasjon i luftveiene og lunge parenchyma av mus. Effektiv pulmonal levering av forbindelser slik som LPS er imidlertid vanskelig å oppnå. I tilnærmingen som beskrives her, er pulmonal levering i mus oppnås ved utfordring til aeroPseudoMonas aeruginosa LPS. LPS ble oppløst aerosoliseres ved hjelp av en forstøver som er koblet til trykkluft. Mus ble utsatt for en kontinuerlig strøm av LPS aerosol i en pleksiglassboks i 10 minutter, etterfulgt av 2 minutter kondisjonering etter at aerosolen ble avbrutt. Trakeal intubasjon og påfølgende bronkoalveolar lavage, fulgt av formalin perfusjon ble deretter utført, noe som gjør det mulig for karakterisering av den sterile pulmonary betennelse. Aerosoliseres LPS genererer en lungebetennelse preget av alveolar neutrofili, oppdaget i bronchoalveolar kylling og ved histologisk vurdering. Denne teknikken kan settes opp på en liten kostnad med noen apparater, og krever minimalt med opplæring og kompetanse. Eksponeringssystemet kan dermed gjennomføres rutinemessig på noe laboratorium, med potensial til å forbedre vår forståelse av lunge patologi.
Lipopolysakkarid (LPS) er en celleveggkomponent av gramnegative bakterier 1. Utfordring til LPS er en veldokumentert modell av akutt lungeskade, et syndrom karakterisert ved akutt nøytrofil inflammasjon og ødem 2. I tillegg er lunge neutrofili også et kjennetegn på kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) 3, og LPS utfordring hos mennesker har blitt brukt til å modellere KOLS eksaserbasjoner 4. Dermed eksperimentelle modeller av LPS eksponering er klinisk relevante og verdifulle verktøy for å forstå menneskelig patologi.
Målet for pulmonal avlevering av aerosoliserte LPS som er beskrevet her, er å generere en nøytrofil inflammatorisk respons i det ledende og luftveiene, uten systemiske reaksjoner. Flere teknikker for LPS utfordringen har vært beskrevet tidligere. Intra-venøs injeksjon av LPS er den mest brukte administrasjonsmåte. Selv om denne teknikken er lett tilgjengelig, tHan primære skaden er til endotelet, med sekundær ødeleggelse av lunge epitel følgende nøytrofil migrering til lungen. Intra-venøs administrering induserer også systemisk inflammasjon 2, noe som kan komplisere det kliniske bildet i dyremodeller. Systemisk inflammasjon er i motsetning ikke observert med intratrakeal administrering. Denne teknikk er imidlertid arbeidskrevende og krever anestetika samt betydelig trening 5, 6. Videre er lunge deponering av denne administrasjons avhengig puste 7. Således er lungeavsetning påvirkes av anestesidybden som er nødvendig for intra tracheal administrering og variabel deponering i luftveiene kan observeres. I motsetning til dette, med aerosolis LPS pulmonal levering krever minimal opplæring, og kan lett oppnås på et stort antall av dyr med liten eller ingen variasjon mellom individer 5, 8.En fersk studie bekrefter at aerosol levering er overlegen den intratrakealt med hensyn til deponering, og at mer relevante doser av LPS indusere nøytrofil inflammasjon med denne modellen 8.
Tidligere studier har vist at utfordring å aerosoliseres Pseudomonas aeruginosa LPS genererer en markert inflammatorisk respons i luftveislumen og lunge parenchyma, inkludert de alveolare rom 9, 10. Betennelsen er preget av en overvekt av nøytrofile og tilstedeværelse av lungeødem, og kan dermed brukes til å adressere patogenesen av akutt lungeskade og få ytterligere kunnskap om mekanismene som bidrar til sykdom patologi.
Aero LPS genererer en inflammatorisk respons i luftveiene, kjennetegnet ved neutrofiler i epithelial submucosa, mellomrom som omgir de ledende luftveier, så vel som de alveolære områder. Dette er, sammen med den økte totale proteininnhold i Balf, en indikasjon på plasmalekkasje, er representative for patologien av akutt lungeskade. Som LPS induserer en steril inflammasjon, er reaksjonen uavhengig av den adaptive immunrespons, og det er begrensninger i relevans for bakterielle infeksjoner. Teknikken kan imidlertid b…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Kerstin Thim (Astrazeneca, Lund, Sverige), Benita Dahlberg og Dr. Anders Eklund (Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige) samt Dr. Martin Stampfli (McMaster University, Hamilton, ON, Canada) for dyktig assistanse og ekspertråd.
Name of the material/equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS | Sigma-Aldrich | Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used. | |
Pari LC sprint star nebulizer | PARI Respiratory Equipment Inc. | 023G1250 | |
TSI mass flowmeter 4040 | TSI | 4040 | Alternative product from supplier may be used. |
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube | Sigma-Aldrich | Z685704 | Recomended brand. |
Plexiglas boxes with removable lids | Custom built | N/A | 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). |
3M Half Facepiece Reusable Respirator | 3M | 7503 | Recomended brand. |
3M Advanced Particulate Filters (P100) | 3M | 2291 | Recomended brand. |
Sissors | VWR | 233-1104 | Preferred scissors may be used. |
Forceps | VWR | 232-1313 | Preferred forceps may be used. |
Intramedic PE50 polyethylene tube | BD | 427411 | Recomended brand. |
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread | VWR | 95056-992 | Recomended brand. |
26 ½ gage needle | Alternative suppliers exist. | ||
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile | BD | 301025 | Alternative suppliers exist. |
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene | BD | 301035 | Alternative suppliers exist. |
Fluka Hematoxylin-Eosin | Sigma-Aldrich | 3972 | Alternative suppliers exist. |
Türk's solution | Merck Millipore | 109277 | |
Table top centrifuge | Alternative manufacturers exist. | ||
Cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | Alternative centrifuge can be used. |
HEMA-3 stat pack | Fisher Scientific | 23-123-869 | Alternative staining kits exists. |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Alternative suppliers exist. |