Summary

Способ генерации легких нейтрофилия Использование аэрозольного липосахарид

Published: December 15, 2014
doi:

Summary

Мы опишем метод индукции нейтрофилов воспаление легких на вызов аэрозольного липополисахарида распылением, для моделирования острого повреждения легких. Кроме того, основные хирургические методы для выделения легких, интубации трахеи и бронхоальвеолярного лаважа, также описаны.

Abstract

Острое повреждение легких (ALI) является серьезным заболеванием, которое характеризуется альвеолярной нейтрофилез с ограниченными возможностями лечения и высокой смертностью. Экспериментальные модели ALI являются ключевыми в повышении нашего понимания патогенеза заболевания. Липополисахарид (LPS), полученный из грамположительных бактерий вызывает нейтрофильный воспаление в дыхательных путях и легких паренхимы мышей. Эффективное легочной доставки соединений, таких как ЛПС, однако, трудно достичь. В подходе, описанном здесь, легочная доставка на мышах достигается вызов аэрозольных синегнойной палочки ЛПС. Растворенный ЛПС аэрозоля с помощью распылителя, подключенного к сжатому воздуху. Мыши подвергались воздействию непрерывного потока аэрозоля LPS в коробке из оргстекла в течение 10 мин, а затем 2 мин после кондиционирования аэрозоль был прекращен. Интубация трахеи и последующее бронхоальвеолярного лаважа, а затем формалина перфузии был следующий выполнены, что позволяет характеристике стерильной рulmonary воспаление. Аэрозольный LPS генерирует воспаление легких характеризуется альвеолярной нейтрофилез, обнаруженных в бронхоальвеолярного лаважа и гистологических. Этот метод может быть создана за небольшую плату с нескольких приборов, и требует минимальной подготовки и опыта. Система экспозиции таким образом, может быть выполнена на регулярной основе на любой лаборатории, с потенциалом для повышения нашего понимания легких патологии.

Introduction

Липополисахарид (ЛПС) является клеточной стенки компонент грамотрицательных бактерий 1. Вызов ЛПС хорошо документированы модель острого повреждения легких, синдром характеризуется острым нейтрофилов воспаления и отека 2. Кроме того, легочная нейтрофилия также отличительной чертой хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) 3, и ЛПС у человека был использован для моделирования ХОБЛ обострений 4. Таким образом, экспериментальные модели воздействия ЛПС клинически значимых и ценных инструментов, чтобы понять патологии человека.

Целью легочной доставки аэрозольных ЛПС, описанных здесь, чтобы генерировать нейтрофильный воспалительную реакцию в проводящей и дыхательных путей, без системного вовлечения. Несколько методик ЛПС были описаны ранее. Внутривенной инъекции LPS является наиболее широко используется способ введения. Хотя этот метод является легко доступным, тОн первичной повреждение к эндотелию, со средним разрушения легочный эпителий следующей миграции нейтрофилов в легкие. Внутривенного введения также вызывает системное воспаление 2, который может осложнить клинической картины на животных моделях. Системное воспаление в отличие не наблюдается с администрацией внутри трахеи. Этот метод, однако, является трудоемким и требует анестетиков, а также значительное подготовку 5, 6. Кроме того, легочной осаждения этого способа введения зависит от дыхания 7. Таким образом, осаждение легких зависит от глубины анестезии, необходимых для можно наблюдать внутри трахеи и введение переменной осаждения в дыхательных путях. В отличие от этого, в легкие с аэрозольными LPS требуется минимальное обучение, и может быть легко достигнуто на большом количестве животных с небольшим или без изменения между индивидами 5, 8.Недавнее исследование подтверждает, что аэрозоль доставка превосходит внутри трахеи маршрута с учетом осаждения, и что более актуальной дозы ЛПС вызвать нейтрофильный воспаление с этой моделью 8.

Предыдущие исследования показали, что вызов в виде аэрозоля Psuedomonas палочки LPS генерирует заметное воспалительной реакции в просвете дыхательных путей и паренхимы легких, в том числе альвеолярных пространств 9, 10. Воспаление характеризуется преобладанием нейтрофилов и наличие отека легких, и, таким образом, может быть использована для решения патогенеза острого повреждения легких и получить дополнительные знания о механизмах, способствующих патологии болезни.

Protocol

Исследования на животных были одобрены этики защиты животных комитета северной части Стокгольма. Экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии со шведским законодательством. 1. Создание ЛПС аэрозолей Растворите 0,5 г очищенного П. палочки ЛПС в 50 …

Representative Results

Вызов аэрозольного P. палочки ЛПС, как правило, дает выраженный воспалительный ответ в просвете дыхательных путей и альвеол пространства, характеризующиеся преобладанием нейтрофилов на обоих ранних и поздних временных точках. Аэрозольный LPS индуцирует легочную ней?…

Discussion

Аэрозольный LPS генерирует воспалительную реакцию в дыхательных путях, характеризуется нейтрофилов в эпителиальных подслизистой, пробелы, окружающие проводящие дыхательные пути, а также альвеолярных пространств. Это, вместе с увеличением общего содержания белка в БАЛ, указателем уте?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Керстин Thim (AstraZeneca, Лунд, Швеция), Бенита Dahlberg и д-р Андерс Эклунд (Каролинского института, Стокгольм, Швеция), а также д-р Мартин Stampfli (Макмастер университет, Гамильтон, Онтарио, Канада) за умелую помощь и консультации экспертов.

Materials

Name of the material/equipment  Company Catalog number Comments/Description
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS  Sigma-Aldrich Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer PARI Respiratory Equipment Inc.  023G1250
TSI mass flowmeter 4040 TSI 4040 Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube Sigma-Aldrich Z685704 Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids Custom built N/A 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). 
3M Half Facepiece Reusable Respirator 3M 7503 Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)  3M 2291 Recomended brand.
Sissors VWR 233-1104 Preferred scissors may be used.
Forceps  VWR 232-1313 Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube BD 427411 Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread  VWR 95056-992 Recomended brand.
26 ½  gage needle  Alternative suppliers exist.
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile BD 301025 Alternative suppliers exist.
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene  BD 301035 Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin Sigma-Aldrich 3972 Alternative suppliers exist.
Türk's solution Merck Millipore 109277
Table top centrifuge Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 Alternative centrifuge can be used. 
HEMA-3 stat pack Fisher Scientific 23-123-869 Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128  Alternative suppliers exist.

Referenzen

  1. King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Innate Immun. 15, 261-312 (2009).
  2. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol Med. 17, 293-307 (2011).
  3. Pesci, A., et al. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).
  4. Hoogerwerf, J. J., et al. Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).
  5. Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract. Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).
  6. Asti, C., et al. Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage. Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).
  7. Brand, P., et al. Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations. Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).
  8. Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
  9. Skerrett, S. J., et al. Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).
  10. Roos, A. B., et al. Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol. Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).
  11. Didon, L., et al. Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke. Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).
  12. Silverpil, E., et al. Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation. Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).
  13. Mercer, P. F., et al. Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).
  14. Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. . Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).
  15. Bafadhel, M., et al. Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).
  16. Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 173, 71-78 (2006).
  17. Rabe, K. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide. J. Vis. Exp. (94), e51470, doi:10.3791/51470 (2014).

View Video