Summary

エアロゾル化リポ多糖を使用して生成肺好中球増加のための方法

Published: December 15, 2014
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Summary

我々は、急性肺損傷をモデル化するために、噴霧によりエアロゾル化したリポ多糖にチャレンジすることにより好中球の肺の炎症を誘導するための方法を記載している。また、肺の分離、気管挿管および気管支肺胞洗浄のための基本的な外科技術も記載されている。

Abstract

急性肺損傷(ALI)限られた治療選択肢と高い死亡率と、肺胞好中球増加によって特徴付け重篤な疾患である。 ALIの実験モデルは、疾患の病因の我々の理解を高める上で鍵となります。グラム陽性細菌由来のリポ多糖(LPS)は、マウスの気道および肺実質における好中球性炎症を誘導する。 LPSのような化合物の効率的な肺送達は、しかし、達成することは困難である。ここに記載されたアプローチでは、マウスでの肺送達は、エアロゾル化された緑膿菌 LPSをチャレンジすることによって達成される。溶存LPSは、圧縮空気に接続ネブライザーによりエアロゾル化した。マウスは、エアロゾルを中止した後、2分間コンディショニングした後、10分間のプレキシグラスボックス内LPSエアロゾルの連続流に暴露した。気管挿管し、滅菌Pの特性評価を可能にし、ホルマリン灌流に続いて、その後の気管支肺胞、次の行われた、ulmonary炎症。エアロゾル化LPSは、気管支肺胞洗浄および組織学的評価によって検出された歯槽好中球増加によって特徴づけられる肺の炎症を、生成されます。この手法は、少数の家電の小さなコストで設置し、最小限のトレーニングと専門知識を必要とすることができます。露光システムは、このように日常的に肺の病理学の理解を向上させる可能性のある、任意の実験室で行うことができる。

Introduction

リポ多糖(LPS)は、グラム陰性菌1の細胞壁成分である。 LPSへの挑戦は、急性肺障害、急性好中球性炎症と浮腫2を特徴とする症候群のよく文書モデルです。また、肺好中球増加はまた、COPD増悪4をモデル化するために使用されている慢性閉塞性肺疾患(COPD)3、およびヒトにおけるLPSチャレンジの特徴である。このように、LPS曝露の実験モデルは、臨床的にヒト病理を理解するための関連、貴重なツールです。

ここで説明するエアロゾル化LPSの肺送達の目的は、全身性の関与なしに、導電性、呼吸気道における好中球の炎症性応答を生成することである。 LPSチャレンジのいくつかの技術が、以前に記載されている。 LPSの静脈内注射は、投与の最も一般的に使用される経路である。この技術は、tは容易にアクセス可能であるが彼の主な損傷は、肺への好中球の移行以下の肺上皮の二次破壊に、内皮にある。静脈内投与は、動物モデルにおいて臨床像を複雑にする全身性炎症2を誘導する。全身性炎症は、気管​​内投与では観察されないとは対照的である。しかしながら、この技術は、労働集約的であり、麻酔剤、ならびにかなりの訓練5,6を必要とする。さらに、この投与経路による肺沈着は、呼吸7に依存している。したがって、肺沈着は、気道内、気管内投与、変数析出が観察され得るために必要な麻酔の深さに影響される。対照的に、エアロゾル化したLPSによる肺送達は、最小限の訓練を必要とし、容易に個人5,8の間にほとんど又は全く変動が多数の動物で行うことができる。最近の研究では、エアロゾル送達が堆積に関して気管内経路よりも優れていること、及びLPSのより適切な用量は、このモデル8と好中球性炎症を誘導することを確認する。

これまでの研究では、エアロゾル化した緑膿菌 LPSへの挑戦は、肺胞腔9、10を含む気道内腔および肺実質の著しい炎症反応を生成し、実証した。炎症は、好中球および肺水腫の存在が優位を特徴とし、従って、急性肺損傷の病因に対処し、疾患の病理学に寄与するメカニズムのさらなる知識を得るために使用することができる。

Protocol

動物研究は、北ストックホルム動物福祉倫理委員会によって承認された。実験手順は、スウェーデンの法律に準拠して行った。 1. LPSエアロゾルの生成 P.精製を0.5g溶解穏やかに撹拌しながら50ミリリットル滅菌生理食塩水中の緑膿菌 LPS及び溶解を確認します。 1mg / mlの最終濃度に9 mlの滅菌生理食塩水にLPSを溶解した1 mlで希釈する。 -20℃でアルミ箔?…

Representative Results

エアロゾル化P.への挑戦緑膿菌 LPSは、通常、両方の初期および後期の時点で好中球の優位性によって特徴づけられる気道内腔および肺胞腔における顕著な炎症反応を、得られます。 エアロゾル化LPSは、肺好中球増加を誘発する C57BL / 6byとBALB / cマウスを、エアロゾル化P.に曝露した緑膿菌 LPS単独車両と好中球がBALF中で数えた?…

Discussion

エアロゾル化LPSは、上皮粘膜下組織中の好中球、誘導気道のほか、肺胞腔を囲むスペースで特徴付けられる気道における炎症反応を、生成されます。これは、一緒に血漿漏出、急性肺障害の病理学の代表を示すBAL​​Fにおける増加し、総タンパク質含有量、である。 LPSは、無菌性炎症を誘導するように、反応は、適応免疫応答とは無関係であり、細菌感染との関連性には限界がある。技術?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、カースティン·ティム(アストラゼネカ、ルンド、スウェーデン)、ベニータダールバーグ博士アンダースエクランド(カロリンスカ研究所、ストックホルム、スウェーデン)だけでなく、熟練した援助のためのドクターマーチンシュテンプフリ(マクマスター大学、ハミルトン、ON、Canada)を感謝したいと思いますと専門家の助言。

Materials

Name of the material/equipment  Company Catalog number Comments/Description
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS  Sigma-Aldrich Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer PARI Respiratory Equipment Inc.  023G1250
TSI mass flowmeter 4040 TSI 4040 Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube Sigma-Aldrich Z685704 Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids Custom built N/A 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). 
3M Half Facepiece Reusable Respirator 3M 7503 Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)  3M 2291 Recomended brand.
Sissors VWR 233-1104 Preferred scissors may be used.
Forceps  VWR 232-1313 Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube BD 427411 Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread  VWR 95056-992 Recomended brand.
26 ½  gage needle  Alternative suppliers exist.
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile BD 301025 Alternative suppliers exist.
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene  BD 301035 Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin Sigma-Aldrich 3972 Alternative suppliers exist.
Türk's solution Merck Millipore 109277
Table top centrifuge Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 Alternative centrifuge can be used. 
HEMA-3 stat pack Fisher Scientific 23-123-869 Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128  Alternative suppliers exist.

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide. J. Vis. Exp. (94), e51470, doi:10.3791/51470 (2014).

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