Demonstrando um multi-resistente<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Ampliação Microarray

Detecção precoce de casos e tratamento rápido são consideradas as estratégias de controle mais eficazes para reduzir o Mycobacterium tuberculosis (MTB) Transmissão ^1, e agora há um amplo consenso na comunidade TB que um ponto de atendimento (POC) ou próximo teste POC para diagnosticar simultaneamente TB e resistência a drogas (DR) é necessária. Tecnologias como GeneXpert de Cepheid e outros testes de amplificação de ácidos nucleicos reduzir o tempo de diagnóstico para muitos pacientes com TB, e proporcionar uma leitura rápida, indicando resistência à rifampicina ou mutações que conferem resistência selecionados para outros de primeira ou segunda linha de medicamentos ^2. Embora ensaios de amplificação em tempo real e de ácidos nucleicos isotérmica são concebidos para identificar as mutações de resistência a drogas que levam a MDR-TB, o espectro de mutações que detectam é muitas vezes inadequada para conceber um regime de droga individualizada correspondente ao perfil de resistência a drogas do paciente, e as restrições técnicas relacionadasde cross-talk óptico ou a complexidade da amplificação e relatórios químicos ^{03-07 maio} limitar o número de loci ou mutações que são detectados. Assim, tecnologias de detecção com maior capacidade de multiplexação são necessárias para suprir as lacunas conhecidas em diagnósticos POC MDR-TB.

Microarrays e Hain ensaios sonda linha OMS endossadas pode resolver o "gene múltiplo, mutações" desafio de diagnosticar MDR-TB ^8-29. Infelizmente, estes, plataformas de detecção multiplexados baseada hibridização usar várias etapas, complicado, e protocolos de amplicon aberto que exigem treinamento e proficiência significativo em técnicas moleculares. O microarray amplificação ³⁰ foi projetado para atender algumas dessas preocupações operacionais microarray work-flow e. Os princípios fluídicos simplificadoras são para amplificar, hibridizar e detectar alvos de ácido nucléico em uma única câmara microfluídicos. O usuário introduz os ácidos nucléicos e amplificação master misturar em uma câmara de fluidos, com uma pipeta e inicia o protocolo de ciclos térmicos. Para o método de processamento do lote mostrado aqui, microarrays são subsequentemente lavadas em solução a granel, seca e fotografada. Este estudo demonstra a funcionalidade de um microarray de amplificação, utilizando um teste de MDR-TB microarray para rpoB (30 mutações), KatG (2 mutações), inhA (4 mutações), rpsL (2 mutações), embB (1 mutação), IS1245, IS6110 , e uma amplificação interna e controlo de hibridação. Pelo menos um par correspondente de sondas de microarray (de tipo selvagem (WT) e mutantes de um único nucleótido (MU)) é incluído para cada mutação de interesse. Ácidos nucleicos purificados de M. multirresistente tuberculose são do Strain TDR Tuberculose Banco ^31. Microarrays elemento Gel são fabricados em substratos de vidro por copolimerização essencialmente como descrito em outra parte ^32, só que usamos 4% e 0,05 mM monômero cada sonda no polymerizmistura ção. As matrizes são rodeados por uma junta de 50 ml, antes da utilização. Depois de ciclos térmicos, hibridação, lavagem e passos, microarrays de amplificação são gravadas em um analisador portátil Akonni. Correção de fundo, intensidades de sinal integrados são obtidos a partir da matéria. Imagens tif usando um algoritmo círculo fixo. Ruído para cada elemento de gel é calculado como três vezes o desvio padrão da mancha de fundo locais. Genes alvos são normalmente considerados detectável por sinal-ruído (SNR) de valores ≥ 3. A fim de determinar a presença ou ausência de uma mutação específica no gene ou cada codão, um rácio discriminante é calculado a partir dos valores de SNR como (WT-MU) / (TP + MU). Rácios discriminantes <0 são indicativos de uma mutação de resistência a drogas no local, enquanto que os rácios> 0 são indicativos da sequência de tipo selvagem.