Summary

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Published: August 24, 2014
doi:

Summary

Das Protokoll für die dynamische Längs Bildgebung und Selective Laser Läsion des Nervenenden in Reporter-transgenen Mäusen wird vorgestellt.

Abstract

Nervenenden in der Haut sind in physiologischen Prozessen wie Abfühlen 1 als auch in pathologischen Prozessen, wie neuropathischem Schmerz 2 beteiligt. Ihre enge-Boden-Positionierung erleichtert mikroskopischen Abbildung von Hautnervenenden in lebenden intakten Tier. Mit Multiphotonen-Mikroskopie ist es möglich, feine Bilder Überwindung des Problems der starken Lichtstreuung des Hautgewebes zu erhalten. Reporter transgenen Mäusen, die EYFP unter der Kontrolle der Thy-1-Promotor in Neuronen (einschließlich Peripherie sensorischen Neuronen) exprimieren, sind für die Längsschnittstudien von einzelnen Nervenenden über längere Zeit gut geeignet bis zu mehreren Monaten oder sogar lebenslang. Außerdem wurde unter Verwendung der gleichen Femtosekundenlaser für die Bildverarbeitung, ist es möglich, hochselektive Läsionen der Nervenfasern für die Studien der Nervenfaser Umstrukturierung erzeugen. Hier, in-vivo-Bildgebung stellen wir ein einfaches und zuverlässiges Protokoll für Mehrphotonen und Längslaserbasierte Mikrochirurgie auf der Haut von Mäusen Nervenenden.

Introduction

Kutanen Nervenenden unterziehen dynamischen Veränderungen unter verschiedenen pathophysiologischen Zuständen. Nervenfasern können durch den Prozess der Degeneration und Regeneration oder Umstrukturierung im Zuge von Krankheiten wie periphere Neuropathie 2 oder Morton-Neurom 3 gehen. Nach einer traumatischen Verletzung, ein wichtiger Bestandteil der Nervenenden in der Haut ist Dynamik reinnervation des beschädigten Bereichs. , Ist der gemeinsame Ansatz zur Untersuchung von Nervenenden jedoch ex vivo histologische Schnitte, die Echtzeit-Informationen über die laufenden Prozesse 4 fehlt. Verwendung genetisch kodierte Fluoreszenzmarker, ist es möglich, die Nervenenden in der Haut von lebenden Tieren zu verfolgen, wodurch man reich und deutlich mehr relevante Informationen über die strukturellen Veränderungen. Die Untersuchung der kutanen Nervenenden ist möglich mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie jedoch die starke Lichtstreuung des Hautgewebes stark untergräbt die Qualitätder Daten erworben 5. Multiphotonenmikroskopie ermöglicht die Erfassung von Bildern mit hoher Auflösung in den stark streuenden Gewebe durch die nicht-lineare Summierung der Energie der Anregungslichtphotonen was zur Emission von Fluoreszenz nur von dem Brennpunkt des Objektivs. Dieser Effekt führt zu einer robusten Zunahme der Eindringtiefe und die Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnis bei der Messung der Hautgewebe 6. Unter Verwendung des gleichen Lasers, wie für die Bildgebung, ist es möglich, eine selektive Zerlegung der Nervenfasern 7 herzustellen. In dem folgenden Protokoll zeigen wir die Methode der Längs Imaging von Hautnervenenden in vivo in transgenen Mäusen Reporter kombiniert mit selektiven Laser-Läsion mit kommerziell erhältlichen Multiphotonen-Mikroskop-System.

Protocol

Verfahren, die tierischen Patienten haben von der Nationalen Tierexperimentierboard, Finnland zugelassen. 1. Vorbereitung der Tiere für Imaging Betäuben eine Maus durch intraperitional (IP) Injektion von Ketamin (0,08 mg pro Körpergewicht) und Xylazin (0,01 mg pro Körpergewicht). Überprüfen Sie die Narkose mit dem hinteren Fuß Prise Reflex. Tauchen Augen Tieres in Augentropfen (Viscotears), um die Augen vor dem Austrocknen zu schützen. Sie mit der Maus auf einem Heizkissen …

Representative Results

Mit dem beschriebenen Verfahren ist es möglich, dieselbe Faser nach der Läsion zu verfolgen und um den Abbau der beschädigten Nervenenden (1) zu untersuchen. Erwerb der Stapel mit der Dicke von 120-150 um ist in der Regel die richtige für die wiederholte Bildgebung während mehreren Tagen um die ganze Faser in das Blickfeld zu halten. Die Läsion kann in der Regel kurz erzeugt werden, wenn das Kunststoffverpackungsmaterial, eingestellt wird, um die Haut zu glätten, so d…

Discussion

In diesem Video zeigen wir die Protokoll-Methode zur nicht-invasiven Längs Zwei-Photonen-Imaging von einzelnen Nervenenden.

Die Dynamik der Haut Innervationen in Krankheiten wie Psoriasis und periphere Neuropathie 2, und in traumatischen Verletzungen 9 betroffen. Zwei-Photonen-Bildgebung ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Nervenfasern Strukturen Kollagenmatrix. Die Verwendung von transgenen Mäusen Reporter hilft, die Probleme der Färbung der Nervenfasern …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Neurotar AG für technische Hilfe, CIMO Stiftung und FGSN für die finanzielle Unterstützung bedanken.

Materials

Round cover glass  Electron Microscopy Science 72296-05 5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears Novartis 2mg/g
Superglue Loctite 401 Henkel 135429
Ketaminol Intervet Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight)
Rompun Bayer Healthcare Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight)
Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1ml  BD 300013
30G 1/2" needles BD 304000
Plastic packaging material Could be purchaized from general hardware store
FV-1000MPE microscope Olympus FV-1000MPE Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective Olympus XLPLN 25XWMP Water imersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2W) SpectraPhysics
Heating pad Supertech TMP-5b Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator Neurotar Ltd.
ImageJ NIH Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ 
Thy1-YFPH mice strain JaxLab 003782

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Yuryev, M., Molotkov, D. In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin. J. Vis. Exp. (90), e51045, doi:10.3791/51045 (2014).

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