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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

Listeria monocytogenes es un patógeno bacteriano Gram positiva utilizado frecuentemente como un modelo importante para el estudio de parasitismo intracelular. Imágenes tardías L. monocytogenes etapas de infección en el contexto de los pequeños ARN de interferencia pantallas permite el estudio global de las vías celulares requeridos para la infección bacteriana de las células huésped diana.

Abstract

Patógenos bacterianos intracelulares pueden ser concebidos como herramientas moleculares para disecar cascadas de señalización celular debido a su capacidad para manipular exquisitamente y subvertir las funciones celulares que se requieren para la infección de tejidos diana del huésped. Entre estos agentes patógenos bacterianos, Listeria monocytogenes es un microorganismo Gram positiva que se ha utilizado como un paradigma para el parasitismo intracelular en la caracterización de la respuesta inmune celular, y que ha desempeñado un papel decisivo en el descubrimiento de las vías moleculares que controlan la dinámica del citoesqueleto y de la membrana de la trata. En este artículo se describe un ensayo microscópico robusta para la detección de las etapas de la infección celular tardías de L. monocytogenes basan en el etiquetado fluorescente de InlC, una proteína secretada bacteriana que se acumula en el citoplasma de las células infectadas; este ensayo se puede acoplar a las pequeñas pantallas de ARN de alto rendimiento de interferencia automatizados con el fin de carbonizarterizar vías de señalización celular implicadas en la altura o hacia abajo-regulación de la infección.

Introduction

La bacteria Gram positiva Listeria monocytogenes es un patógeno transmitido por los alimentos que invade las células huésped, interrumpe su vacuola internalización y se replica en el citoplasma de las células huésped 1. L. monocytogenes facilidad de manipulación en el contexto de laboratorio (rápido crecimiento, baja toxicidad para los individuos sanos) asociado con la persistencia de rasgos de virulencia bacterianas observadas en modelos celulares y animales (actividad hemolítica, leucocitosis) permite su uso inicial en la década de 1960 como un modelo importante para el estudio de parasitismo intracelular y para el establecimiento de los fundamentos teóricos de la inmunidad celular contra la infección 2. A finales de 1980 y principios de 1990, la disección del ciclo intracelular bacteriano 3, así como la caracterización molecular de la virulencia bacteriana más importante factores de 4-7 favoreció el uso de L. monocytogenes como una herramienta clave molecular para la manipulación y el pernoy de las funciones de la célula huésped. La presencia de no virulenta (L. innocua) y (Listeria monocytogenes) especies virulentas en el género Listeria allanaron el camino para estudios genómicos comparativos 8 que, junto con la reciente creación de la completa L. monocytogenes transcriptoma 9, han aumentado nuestra comprensión de la evolución de la L. monocytogenes como un patógeno humano y como un sistema modelo para estudios de infección 10.

L. monocytogenes induce su internalización en las células huésped en la interacción de las proteínas de la superficie bacteriana INLA y InlB con sus receptores de células huésped E-cadherina y Met, respectivamente 11-12. Estudios basados ​​en la candidata inicial condujeron a la identificación del enlace cateninas-actina α / β como un componente importante de la vía InlA-13 y la invasión de la fosfoinosítido 3-quinasa (PI 3-K) como un efector crítico de la InlB- casca invasión dependientede 14-15. Ensayos proteómicos y basados ​​funcional posteriormente permitieron la identificación de nuevos elementos del citoesqueleto y 16 segundos mensajeros lipídicos 17 requeridos para la invasión de la célula huésped. Estudios transcripcionales 18 y proteómica cuantitativa basada en la espectrometría de masas 19 se han esclarecido algunos puntos en relación con la activación de cascadas de señalización de acogida y la represión de la respuesta inmune durante la L. monocytogenes infección. La biología de sistemas se acerca basado en la inactivación de los grandes conjuntos de genes (kinomes, genomas completos) por pequeños ARN de interferencia (siRNA) silenciamiento se han abierto recientemente nuevas vías para el análisis de la serie mundial de las cascadas de señalización en el contexto de las funciones celulares específicas, incluyendo la fagocitosis y internalización patógeno 20. Pantallas siRNA del genoma completo han realizado anteriormente para investigar cascadas celulares requeridos para la infección de L. monocytogenes en fagocítica Drosophila 21-22, pero este tipo de análisis no ha sido realizado en las células no fagocíticas, que representan objetivos críticos para la infección in vivo.

Hemos optimizado un protocolo para la detección microscópica de las etapas tardías de la infección por L. monocytogenes que es adecuado para siRNA estudios de alto rendimiento de la entrada de bacterias dentro de las células epiteliales. Nuestro ensayo se aprovecha de una L. altamente invasiva monocytogenes cepa que presenta una mutación puntual en PrfA, el principal regulador de la transcripción de L. monocytogenes factores de virulencia 6: esta mutación (llamado PrfA *) hace que PrfA constitutivamente activa 23 y conduce a un aumento de la expresión de las proteínas de invasión inlA y InlB, por lo tanto, favorecer la entrada de bacterias en células no fagocíticas de lo contrario pobremente infectados. Nuestra lectura para la infección se basa en la detección de la acumulación citosólica de la secretada InlC proteína bacteriana: esta molécula esun efector pleiotrópica que se expresa preferentemente por intra-citoplasmática L. monocytogenes 9 y que participa no sólo en la célula de células-a-bacteriana propagan 24 pero que también modula las respuestas inmunes del huésped 25. El marcaje fluorescente de la secreción de InlC por bacterias intracelulares no sólo permite distinguir claramente infectado a partir de células no infectadas, sino que también representa una lectura de punto final que se puede utilizar para diseccionar posteriormente infección en sus diferentes pasos: entrada, de escape vacuolar, citosólica bacteriana la proliferación y propagación de célula a célula. Este protocolo basado en microscopía-puede estar acoplado a las pantallas de siRNA por lo tanto, para estudiar las vías celulares implicadas en la infección de células huésped por L. monocytogenes.

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Protocol

1. Preparación de Celular y bacterianas Culturas, Herramientas de transfección y Anticuerpos primarios

  1. Preparar una placa de agar fresco para aislar individuo L. monocytogenes colonias a partir de un stock de glicerol bacteriana (50% glycerol/50% saturada cultivo de una noche de líquido bacteriano) mantuvo a -80 ° C.
    1. El uso de un bastidor de aluminio (se mantiene a -80 ° C) para el transporte de un Congelados glicerol bacteriana de valores, las bacterias del rayado en una infusión de corazón cerebro (BHI) placa de agar.
    2. Incubar la placa a 37 ° C durante 48 h (o hasta que las colonias bacterianas individuales se pueden aislar).
    3. Mantenga esta placa de trabajo después a 4 º C durante un tiempo máximo de 1 mes (que será utilizado para sembrar cultivos líquidos).
    4. En el protocolo, se utiliza el L. monocytogenes serotipo 1/2a EGDe.PrfA * cepa, pero como se ilustra en la Figura 1, la L. serotipo monocytogenes 4b P14.PrfA * Cepa da resultados similares.
  2. ÉlLa ATCC CCL2 células se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) en ausencia de antibióticos.
  3. Piscinas independientes de revuelto (control) y los anti-Met siRNAs se cargan en 384-y placas de cultivo celular de microscopía negros.
    1. Diluir 160 pmoles de siRNA en 500 l de RNasa libre de agua y añadir 5 l de esta solución por pocillo (concentración final: 1,6 pmol).
    2. Mantenga esta placa a -20 ° C durante un período máximo de 1 año.
  4. Anticuerpos de conejo policlonales contra la proteína bacteriana InlC se han obtenido mediante inmunización usando una proteína recombinante GST-InlC como se ha descrito previamente 25.

2. Invierta siRNA transfección celular

  1. 72 horas antes de la infección llevar a temperatura ambiente un 384-así placa de cultivo celular microscopia negro que contiene 1,6 pmol siRNA en 5 l de RNasa libre de agua en cada pozo.
  2. Se centrifuga la placa durante 3 minutos a 300fcr a temperatura ambiente para reducir siRNA que podrían haber sido depositados en las paredes de los pozos.
  3. Preparar habitación DMEM suplementado con temperatura 0,4% Lipofectamine RNAiMAX.
  4. Añadir 25 l de medio de transfección DMEM / RNAiMAX a cada pocillo (no incubar el medio de transfección más de 20 min antes de añadir a la ARNsi).
  5. Mueva la placa de un lado a otro para mezclar el siRNA con la solución de transfección, a continuación, mantener la placa durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir complejos de siRNA Lipofectamine a la forma.
  6. Lavar las células HeLa de un frasco confluente o cultivo celular sub-confluente una vez con 10 ml 37 ° C PBS precalentado.
  7. Separar las células HeLa mediante la adición de 1 ml de 37 ° C precalentado tripsina al matraz de cultivo celular y se incuba durante 3 a 5 min a 37 ° C.
  8. Vuelva a suspender las células en 10 ml 37 ° C precalentado DMEM suplementado con 16% de SFB.
  9. Contar las células y preparar una suspensión de células de 12.000 células por ml en DMEM suplementado con16% de FBS.
  10. Añadir 50 l de la suspensión celular a cada pocillo en la placa de 384 pocillos.
  11. Mueva la placa rápidamente hacia adelante y hacia atrás para distribuir las células y dejar que se calmen las células durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  12. Sellar la placa con Parafilm y mantenerlo durante 72 horas en un 5% de CO 2 que contienen atmósfera húmeda a 37 ° C.

3. La infección celular y tinción

  1. El día antes de la infección, tome una sola colonia de L. monocytogenes de la placa de agar BHI y resuspender en 5 ml de medio BHI líquido en un tubo de poliestireno de 15 ml.
  2. Incubar durante la noche a 37 ° C en un dispositivo de shacking para permitir el crecimiento bacteriano.
  3. El día de la infección, lave 1 ml de la noche a la mañana L. monocytogenes cultura centrifugando 2 min a 10.600 FCR en una centrífuga de mesa.
  4. Descartar el sobrenadante (que contiene el secretado listeriolisina citotoxina O) y resuspender el precipitado en 1 ml de PBS (REPEAt la etapa de lavado 3 veces más).
  5. Leer la densidad óptica a 600 nm bacteriana y estimar el número de bacterias (OD = 1 es equivalente a 1E9 bacterias / ml).
  6. Prepare la adecuada L. monocytogenes dilución en DMEM suplementado con 1% de SFB: el uso de cepas altamente invasivos como EGDe.PrfA *, se sugiere el uso de bacterias 5E4 en 30 l de medio por pocillo (la multiplicidad de la infección se estima en 25 por 2.000 células).
  7. Retire el medio de cultivo celular en cada pocillo (80 l) y sustituirla por la adición de 30 l de la L. monocytogenes que contienen medio.
  8. Centrifugar la placa a 200 rcf durante 5 min a temperatura ambiente para sincronizar el proceso de infección.
  9. Incubar la placa durante 1 hora en un 5% de CO 2 que contienen atmósfera húmeda a 37 ° C en un bloque de aluminio precalentado.
  10. Retire la L. monocytogenes que contienen medio de cada pocillo y añadir 30 l de DMEM precalentado suplementado con 10% de FBS y40 mg / ml de gentamicina para matar extracelular L. monocytogenes.
  11. Se incuba durante 4 horas en un CO 2-atmósfera que contiene 5% a 37 ° C en un bloque metálico precalentado.
  12. Preparar una solución de PBS suplementado con 8% de formaldehído (esta solución debe prepararse fresca de modo que los monómeros de formaldehído, en lugar de los polímeros de paraformaldehído, se utilizan).
  13. Sin desechar el medio de cultivo de células, añadir 30 l de PBS suplementado con 8% de formaldehído (concentración final: 4%) y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
  14. Quite el fijador y lavar las células tres veces con 80 l de PBS por pocillo (mantener las células en un volumen final de 80 l de PBS por pocillo).
  15. Preparar una dilución 1:250 del anticuerpo de conejo anti-InlC suero en PBS suplementado con 0,2% de saponina.
  16. Añadir 10 l de la solución de anticuerpo primario a cada pocillo después de retirar el PBS y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
  17. Deseche la primariasolución de anticuerpo y lavar cuatro veces con 40 l de PBS por pocillo.
  18. Diluir el anticuerpo secundario Alexa Fluor 546 acoplado-anti-conejo (1:250), la solución de DAPI (1:1.500) y faloidina-Dy647 (1:150) en PBS suplementado con 0,2% de saponina.
  19. Añadir 10 l de esta solución de tinción secundaria a cada pocillo e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  20. Deseche la solución de tinción secundaria y lavar cuatro veces con 40 l de PBS por pocillo (dejar un volumen final de 40 l en cada pocillo y sellar la placa).
  21. La placa se pueden visualizar inmediatamente o se puede almacenar a 4 ° C protegido de la luz (cubrir con papel de aluminio) para su posterior análisis.

4. Adquisición de imágenes y análisis

  1. Adquirir imágenes en tres canales diferentes (350 nm, 546 nm y 647 nm) utilizando un objetivo de 10X montada en un microscopio automatizado (adquirir con preferencia 9 imágenes por pocillo).
  2. La señal de InlC se puede medir usando la imagensoftware de análisis como CellProfiler que permite la segmentación automatizada de núcleos y cuerpos celulares utilizando el DAPI y la tinción phalloidin, respectivamente.

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Representative Results

Etiquetado fluorescente de citoplasmática InlC proporciona una lectura robusta para la infección de células por L. monocytogenes, como se ilustra en la Figura 1: la célula central en la micrografía es altamente infectadas por la cepa P14.PrfA * 23 como se puede observar en la imagen de contraste de fase (puntas de flecha, Figura 1A) y se confirma por la señal DAPI donde bacterias individuales se pueden distinguir con claridad (fig. 1B). La tinción InlC (superpuesta a la tinción DAPI en la Figura 1C) muestra cómo esta proteína secretada densamente se acumula en el citosol de las células infectadas y permite una detección inequívoca de la morfología de la célula huésped infectada. La tinción del citoesqueleto de actina con faloidina fluorescente (Figura 1D) proporciona información sobre la morfología de la monocapa celular inoculada completa y además ilustra cómo vecinos no infectados células (núcleos de las células marcadas con un asterisco) do no se muestre ningún etiquetado InlC. Vale la pena mencionar que, ya que los niveles citosólicos InlC dependen del número de bacterias citoplasmáticas, hemos observado una correlación entre la señal de InlC detectado por inmunofluorescencia y el número de L. monocytogenes por célula: como se observa en la Figura 1, las células vecinas infectadas con el número de bacterias bajos muestran una tinción InlC reducida que puede cuantificarse. Curiosamente, también es posible observar que InlC se detecta fácilmente en los salientes formados por las bacterias atrapadas en el proceso de propagación de célula a célula (Figura 1C) como se observa también con la tinción de actina (Figura 1D). De nota, las bacterias no se tiñen directamente en el protocolo, pero ya que no se utiliza el canal de 488 nm, L. monocytogenes puede marcarse usando un suero anti-bacteriana específica, de lo contrario, las bacterias que expresan GFP, alternativamente, se pueden utilizar.

El uso de herramientas de análisis de imágenes, tales como tCellProfiler él software público (Instituto Broad, www.cellprofiler.org ), es posible que las células de segmento y para medir la señal de InlC en las células infectadas individuales, que se puede utilizar para estimar un índice de infección para una condición experimental específica. Como se muestra en la Figura 2, el etiquetado de los núcleos con DAPI (Figura 2A) y el citoesqueleto de actina con faloidina (Figura 2 C) proporcionan la información necesaria para la segmentación celular: los núcleos se utilizan como objetos de referencia para la identificación de células individuales (Figura 2B) y el citoplasma se identificó posteriormente utilizando una función de dispersión de los núcleos que tiene en cuenta la señal del citoesqueleto (Figura 2D). Finalmente, la intensidad de la señal de InlC se puede cuantificar para cada objeto identificado celular (Figuras 2E y 2F) para estimar el número delas células infectadas mediante el establecimiento de un umbral para la intensidad InlC que consideramos como negativo. El índice de infección se calcula como el número de células infectadas dividido por el número total de células en la población.

Nuestro protocolo se puede acoplar a las pantallas de siRNA para investigar la función de los paneles grandes de moléculas diana en la infección de células huésped por L. monocytogenes. Se requieren controles para validar la eficacia de la transfección: por ejemplo, siRNA dirigidos Kif11 es un control comúnmente utilizado para la transfección que conduce a la muerte celular, y por lo tanto la ausencia de células al final del ensayo es una indicación de que la transfección procedió de manera eficiente. Para abordar específicamente la L. monocytogenes proceso de invasión, ARNsi inactivación del receptor celular Met en células HeLa conduce a una importante inhibición de la entrada bacteriana en las células huésped y conduce a niveles muy bajos de células InlC-positivos en una monocapa celular inoculada (Figura3A) en comparación con las células tratadas con un control de siRNA revueltos (Figura 3B). La función de moléculas desconocidas candidatos se puede investigar con nuestro ensayo usando esta molécula celular conocido como estándar.

Figura 1
Figura 1. La detección de etiquetado InlC en células HeLa infectadas con L. monocytogenes cepa P14.PrfA *. células HeLa CCL2 han sido infectadas como se describe en el protocolo, se procesaron para inmunofluorescencia y fotografiado usando un objetivo de 63X. (A) Imagen de contraste de fase, varias P14.PrfA * bacterias se indican con flechas. (B) tinción DAPI (azul), las mismas bacterias individuales como en (A) se etiquetan mediante puntas de flecha. (C) Superposición de la tinción con DAPI (azul) y elTinción InlC (rojo), los núcleos de las células no infectadas están etiquetados por un asterisco. (D) La superposición del InlC (rojo) y actina (verde) señales. Bar:. 5 m Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2
Figura 2. Análisis de segmentación de las células HeLa infectadas con L. monocytogenes cepa EGDe.PrfA *. células HeLa CCL2 se infectaron como se describe en el protocolo, se procesaron para inmunofluorescencia y fotografiado usando un objetivo de 10X. (A) Señal de DAPI. (B) Superposición de la señal DAPI (azul) que se muestra en (A) y la señal de actina (rojo) que se muestra en (C) que muestra la segmentación de los núcleos (VIew recuadro ampliado). (C) Señal de actina. (D) La misma imagen como (B) que muestra la segmentación de las células. (E) Señal InlC. (F) La misma imagen como (D) con superposición de la tinción InlC (amarillo). Bar:. 50 m Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 3
Figura 3. . Variación del etiquetado InlC entre las células inactivadas para Met y células de control de células HeLa CCL2 fueron inicialmente revertir-transfectadas con un grupo de cuatro siRNAs dirigidos al receptor de célula huésped Met; 72 h después de la transfección, las células fueron infectadas como se describe, se procesaron para inmunofluorescencia y fotografiado usando un objeto 10 vecesive. (A) Superposición de la DAPI (azul), actina (rojo) y InlC (amarillo) en las células inactivadas para Met. (B) Los mismos canales que en (a) en relación con las células tratadas con un siRNA control revueltos. Bar:. 50 m Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Discussion

Varios parámetros son críticos para el éxito de nuestro protocolo InlC-detección, incluyendo el uso de líneas de células sanas que muestran un citoplasma suficientemente grande para permitir una detección inequívoca de la señal de InlC. En el ensayo se presentan en este artículo se propone el uso de células HeLa CCL2, que son particularmente muy adecuado para nuestro ensayo debido a la extensión de su espacio citosólico; otros clones de HeLa tales como células HeLa Kioto muestran un citoplasma más pequeña, pero se pueden utilizar con nuestro protocolo de infección (células HeLa Kioto están particularmente bien adaptados para el análisis de la segmentación ya que las células no se superpongan con las células vecinas, lo cual es a menudo el caso de las células HeLa CCL2). Las células que presentan una muy pequeña citoplasma, como las células polimorfonucleares o macrófagos no se recomiendan para su uso en combinación con nuestro protocolo.

Una limitación de un protocolo de imagen como la que presentamos aquí es el hecho de que una cantidad mínima de células debe ser INFEcted, en una monocapa dada en las condiciones de control, con el fin de proporcionar el sistema con suficiente poder resolutivo: de lo contrario, si se infectan pocas células, se hace difícil determinar los cambios en las tasas de infección, especialmente cuando la investigación de la función de potenciales candidatos moleculares que son espera que reduzca la infección. Esta limitación representa un verdadero problema cuando se utilizan células HeLa que expresan satisfarán como el único receptor de la superficie de la L. monocytogenes proteína InlB y están, por tanto, poco invadida por mayor L. monocytogenes cepas. Una alternativa es utilizar una muy alta multiplicidad de infección (MOI> 100) que puede aumentar el número de bacterias invasivas sino que también aumenta el riesgo de daño celular debido a los niveles más elevados en el medio de cultivo celular de la formación de la toxina bacteriana de poro listeriolisina O ( LLO), que muestra una actividad citotóxica muy potente. Otra alternativa es el uso de cepas de super-invasivos, tales como la cepa EGDe.PrfA * presentado en nuestro protocolo, Que permite el uso de una MOI baja (<25) y reduce la cantidad de efectos citotóxicos LLO-dependiente; resultados obtenidos con una L. monocytogenes cepa súper-invasivo puede ser validado posteriormente utilizando otras cepas bacterianas menos virulentas en otros tipos de ensayos (ver más abajo). Una tercera alternativa es el uso de una línea celular diferente que se expresa tanto en la E-cadherina y Met: es el caso de las líneas celulares, como las células del trofoblasto como JEG3 o BeWo, o las células de carcinoma de colon LoVo, que pueden ser invadidos por tanto el de las vías de entrada InlB dependientes InlA-y, en estas líneas celulares, las tasas más altas de infección de células se puede llegar utilizando L. monocytogenes cepas como EGDe, la cepa parental de EGDe.PrfA *. Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que la redundancia de las funciones en las dos vías puede conducir a efectos de compensación en una vía cuando un efector se inactiva en la otra vía, haciendo que el análisis de los resultados difícil. También es importante mencionar THAcélulas T no deben ser sobre-infectada con el fin de proporcionar el sistema con un buen rango dinámico que permite la detección de eventos que aumentan la infección: en nuestro protocolo particular, nuestra MOI conduce a una tasa de infección óptima de 30%.

Los métodos alternativos para el estudio de la invasión de las células huésped por L. monocytogenes incluyen el ensayo de invasión de gentamicina clásica 26 que se basa en la destrucción de las bacterias extracelulares mediante la adición de gentamicina al medio de cultivo celular después de un período inicial de la infección bacteriana (similar al procedimiento presentado en la primera parte de nuestro protocolo de infección) y invasión se obtuvo mediante siembra de las bacterias intracelulares que sobrevivieron en placas de agar y contando el número de unidades formadoras de colonias (UFC) que crecen en estas placas. Este método presenta la ventaja de utilizar la lectura más directa para la infección, que es el número preciso de las bacterias invasoras que son en realidad protegida del trat gentamicinant en el espacio citoplásmico de células huésped, sin embargo, este método presenta un solo lectura para la infección y una vez que las células huésped se lisan para liberar UFC intracelulares, ya no hay un registro para obtener información sobre el estado real de las células en el punto final del experimento. El protocolo se basa en un método indirecto, la detección de la proteína secretada InlC, pero como se mencionó anteriormente, los niveles de InlC citoplásmica se correlaciona con el número de citosólica L. monocytogenes (Figura 1). Además, la naturaleza intrínseca de nuestro ensayo de microscopía permite establecer claramente la situación precisa de las células al final de la infección: por lo tanto, podemos extraer información relativa a la morfología celular global, la distribución del citoesqueleto de actina, fase del ciclo celular, etc y realizar alto contenido análisis de la infección. Una característica importante que se puede extraer de este tipo de análisis es el contexto de la población y su influencia sobre la infección: De hecho, el trabajo reciente de Pelkmans y compañeros de trabajo 27 demostró que el contexto particular de la población de una célula dada (por ejemplo, su posición desde la periferia dentro de un grupo de células en un islote) afecta a varias funciones celulares incluyendo la endocitosis y la susceptibilidad a la infección por el virus. Por lo tanto, Nuestro ensayo presenta el potencial para la extracción de esta información.

Nuestro método presenta una ventaja adicional: desde InlC es una lectura tardía de la infección debido a su secreción por bacterias citoplasmáticos, las vías de señalización de receptores que afectan los niveles de acumulación InlC en células huésped potencialmente podrían afectar no sólo la entrada de bacterias, sino también de escape vacuolar, la proliferación y citosólica célula a la larga difusión celular. Por lo tanto, nuestro método se puede utilizar como una lectura primaria para la infección global y se puede acoplar a ensayos secundarios para diseccionar la etapa de infección específica que ha sido perturbado por el golpe primaria identificados a través de las pantallas de siRNA. Finalmente, es importante mencionar que nuestro método se puede mejorar la resolución y totalmente automatizado utilizando dispositivos lavador de placas, incrementando por lo tanto el número de muestras analizadas en un solo experimento mientras que disminuye el nivel de variación de los resultados en comparación con los experimentos llevados a cabo manualmente.

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Disclosures

No tenemos nada que revelar.

Acknowledgments

La investigación en el laboratorio de P. Cossart es apoyado por el Instituto Pasteur, el Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale, el Instituto Nacional de Investigación Agronómica, ERC Advanced Grant (233.348), la Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), la Fundación Louis-Jeantet y la Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK es un beneficiario de una beca de la Universidad de París-Pasteur Internacional de Doctorado del programa / Institut Carnot Maladies infectieuses. Damos las gracias a Jason Mercer para la optimización del protocolo de transfección celular.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
  2. Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
  3. Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
  4. Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
  5. Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
  6. Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
  7. Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
  8. Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
  9. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  10. Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
  11. Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
  12. Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
  13. Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
  14. Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
  15. Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
  16. Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
  17. Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
  18. Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
  19. Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
  20. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  22. Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
  23. Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
  24. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
  25. Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
  26. Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
  27. Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).

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Inmunología Número 79 células HeLa Listeria monocytogenes infecciones bacterianas gram-positivas fluorescencia selección de alto rendimiento ensayos la interferencia de ARN Listeria monocytogenes la infección la microscopía pequeños ARN de interferencia

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em
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Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

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