Agroinfiltração e agroinfecção PVX são ensaios funcionais de rotina para expressão ectópica transitória de genes nas plantas. Esses métodos são ensaios eficientes em estratégias de efeitoomia (resistência rápida e descoberta genética de avirulência) e cruciais para pesquisas modernas em patologia molecular vegetal. Eles atendem à demanda por uma análise funcional robusta de alto rendimento nas plantas.
Agroinfiltração e agroinfecção PVX são dois ensaios eficientes de expressão transitória para análise funcional de genes candidatos em plantas. O agente mais usado para a agroinfiltração é o Agrobacterium tumefaciens, um patógeno de muitas espécies de plantas dicot. Isso implica que a agroinfiltração pode ser aplicada a muitas espécies vegetais. Aqui, apresentamos nossos protocolos e resultados esperados ao aplicar esses métodos à batata (Solanum tuberosum),suas espécies de Solanum com tubos selvagens relacionados (seçãode Solanum Petota) e a planta modelo Nicotiana benthamiana. Além da análise funcional de genes únicos, como genes de resistência (R) ou avirulência(Avr),o ensaio de agroinfiltração é muito adequado para recapitular as interações R-AVR associadas a interações específicas de patógenos hospedeiros, simplesmente fornecendo transgenes R e Avr na mesma célula. No entanto, alguns genótipos vegetais podem aumentar as respostas de defesa inespecíficas ao Agrobacterium,como observamos, por exemplo, para vários genótipos de batata. Em comparação com a agroinfiltração, a detecção da atividade de AVR com agroinfecção PVX é mais sensível, mais elevada em telas funcionais e menos sensível às respostas de defesa inespecíficas ao Agrobacterium. No entanto, a defesa inespecífica ao PVX pode ocorrer e há o risco de perder respostas devido à resistência extrema induzida pelo vírus. Apesar dessas limitações, em nossa experiência, a agroinfiltração e a agroinfecção PVX são ensaios adequados e complementares que podem ser usados simultaneamente para confirmar os resultados uns dos outros.
Effectoromics, uma abordagem genômica funcional de alto rendimento surgiu recentemente como uma poderosa ferramenta para identificar genes de resistência (R) em plantas de cultura e avirulência correspondente(Avr) genes de patógenos1-4. Em contraste com a transformação estável mais demorada com genes R, a estratégia de efeitosomómicas é baseada em ensaios transitórios de sequências genéticas patógenas.
Desde a era genômica, genomas de patógenos vegetais têm sido amplamente explorados. Por exemplo, para oomycetes, que incluem os patógenos vegetais mais devastadores, grandes coleções de sequências foram geradas e analisadas para genes que desempenham um papel durante a interação com a planta5-10. Uma classe de proteínas patógenas representa os efeitos, que manipulam a estrutura e a função das células hospedeiras, seja para facilitar a infecção (fatores de virulência) ou para desencadear respostas de defesa (fatores de avirulência)11-13. Expressão de genes Avr em células vegetais contendo genes R geralmente resulta na resposta de morte celular hipersensível (HR)14,15. Na expressão de planta de genes R e Avr pode ser realizada utilizando sistemas de expressão transitória, como tumefaciens agrobacterium –transformação transitória baseada (agroinfiltração)16. Essa transformação transitória também pode ser aplicada em combinação com sistemas de expressão viral (agroinfecção)17,18.
Para a agroinfiltração, o agente mais usado é a A . tumefaciens, um amplo patógeno de gama hospedeira de plantas dicot. A . tumefaciens contém um plasmídeo indutor de tumor (Ti). Transferir DNA (T-DNA) de um plasmídeo ti será translocado para as células vegetais depois que o maquinário de virulência da bactéria for ativado. Isso pode ser desencadeado em células vegetais feridas, pelos compostos fenólicos de baixo peso molecular e monossacaraides em um ambiente ligeiramente ácido19. O gene da virulência é ativado após a infiltração de suspensões de Agrobacterium em painéis de folhas definidos por veias principais. Em seguida, as células vegetais nos painéis das folhas serão transformadas e expressarão os transgenes contidos na região do T-DNA.
A agroinfecção é baseada no Agrobacteriuminoculado de feridas, que media a translocação de um vírus para células vegetais. O vírus então se espalha ainda mais para tecidos vegetais adjacentes, na ausência de Agrobacterium. Para a agroinfecção, vários vírus vegetais podem ser usados. Os vírus RNA são vetores ideais para a expressão genética porque podem se multiplicar a níveis muito altos em plantas infectadas. Entre os vírus do RNA vegetal, o Vírus da Batata X (PVX) é amplamente utilizado para telas de efeitosomómicos. Para facilitar testes funcionais para um gene inserido, vetores binários que contêm o genoma PVX ladeado pelo promotor do vírus mosaico de couve-flor 35S e o exterminador de synthase nopaline, foram clonados no T-DNA de A. tumefaciens20. Depois que o T-DNA é transferido para células vegetais, o genoma PVX contido no T-DNA é transcrito pelo promotor do 35S. Em seguida, as partículas de vírus se espalham sistemicamente nas plantas infectadas, resultando na expressão do gene inserido. Este método baseado tanto na Agrobacterium quanto no PVX é chamado de agroinfecção PVX.
Aqui mostramos exemplos tanto para os ensaios de agroinfiltração quanto de agroinfecção PVX. Como plantas hospedeiras usamos germoplasma de batata ( seçãode solanum Petota),para a qual as abordagens de efeitos foram pioneiras e comprovadamente bem sucedidas3,4. Também utilizamos Nicotiana benthamiana, que é reconhecida como uma planta modelo em plantas solanáceas 14,21,22.
Ensaios transitórios como agroinfiltração e agroinfecção são métodos eficientes que são vitais para a pesquisa moderna de patologia molecular vegetal. Apesar de algumas limitações, esses métodos atendem à demanda por análises funcionais eficientes e robustas de alto rendimento nas plantas.
O sistema de agroinfiltração é um ensaio funcional amplamente utilizado em uma variedade de espécies vegetais. A agroinfiltração facilita a entrega de vários transgenes na mesma célula com expressão simultânea de proteínas interativas. Isso é vantajoso para recapitular as relações R-AVR, por cunhar cepas de Agrobacterium que expressam genes Avr com cepas que expressam os genes R correspondentes. Além disso, para pares R-AVR conhecidos, tais coinfiltrações podem ser usadas como controles positivos. Incluir tais controles é importante porque em alguns genótipos de plantas, a eficiência de transformação pode estar abaixo do limiar para detectar respostas. A inclusão de controles negativos, por exemplo, uma cepa de Agrobacterium contendo um vetor sem uma inserção genética, também é essencial para determinar se um determinado genótipo vegetal levanta respostas de defesa inespecíficas ao Agrobacterium. Essa característica ocorre em uma certa frequência no germoplasma da batata, e nem todas as espécies de Solanum são adequadas para este sistema de expressão baseado em Agrobacterium. Geralmente, o ensaio de agroinfiltração funciona muito bem em N. benthamiana e na maioria dos genótipos de batata. Além da efetivação da biodinâmica, existem várias outras aplicações potenciais para a técnica de agroinfiltração, como a produção de proteínas a partir de transgenes e localização de proteínas em células vegetais por microscopia confocal.
A agroinfecção PVX é um sistema de triagem altamente sensível e tipicamente mais adequado para triagens de alto rendimento. Uma vez que o Agrobacterium está agora apenas localmente presente, as respostas inespecíficas a esta bactéria não são agora muito perturbadoras, uma vez que o vírus PVX assume uma maior disseminação do transgene. No entanto, as plantas podem ser resistentes ao PVX, ou montar respostas de resistência extrema (ER), e nesse caso o método de agroinfecção não é adequado. Outra limitação do método de agroinfecção PVX é o tamanho da inserção do gene de interesse. Fenótipos observados de respostas podem variar de uma intensa necrose negra ao redor da ferida até necrose fraca perto do ponto de inoculação. Tanto nas espécies N. benthamiana quanto solanum, a agroinfecção PVX é reconhecida como mais sensível do que a agroinfiltração.
Mantendo em conta que o fundo genético dos diversos genótipos vegetais testados pode ter algumas restrições (veja acima), geralmente obtemos conclusões semelhantes por agroinfecção pvx e agroinfiltração. Esses resultados também são comparáveis como obtidos em outros ensaios, como infiltrações proteicas29 e ELISA3. Considerando as vantagens e limitações de ambos os sistemas, recomendamos usar ambos os métodos para complementar um ao outro ou confirmar resultados independentes.
The authors have nothing to disclose.
O trabalho é parcialmente apoiado pelo Wageningen University Fund (WUF), China Scholarship Council Program for Graduate Students e uma bolsa NWO-VIDI 12378.
Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
Incubator | Infors HT | Multitron II | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |