L’agroinfiltrazione e l’agroinfezione PVX sono test funzionali di routine per l’espressione ectopica transitoria dei geni nelle piante. Questi metodi sono test efficienti nelle strategie di effettioromica (rapida resistenza e scoperta del gene dell’avirulenza) e cruciali per la moderna ricerca nella patologia vegetale molecolare. Soddisfano la domanda di solide analisi funzionali ad alta produttività negli impianti.
Agroinfiltrazione e agroinfezione PVX sono due efficaci saggi di espressione transitoria per l’analisi funzionale dei geni candidati nelle piante. L’agente più comunemente usato per l’agroinfiltrazione è Agrobacterium tumefaciens, un agente patogeno di molte specie di piante dicot. Ciò implica che l’agroinfiltrazione può essere applicata a molte specie vegetali. Qui presentiamo i nostri protocolli e i risultati attesi quando applichiamo questi metodi allapatata (Solanum tuberosum),alle sue specie solanum porta tuberiche selvatiche correlate(sezione Solanum Petota)e alla pianta modello Nicotiana benthamiana. Oltre all’analisi funzionale di singoli geni, come i geni di resistenza (R) o avirulenza(Avr), il saggio di agroinfiltrazione è molto adatto per ricapitolare le interazioni R-AVR associate a specifiche interazioni patogene ospiti semplicemente fornendo transgeni R e Avr nella stessa cellula. Tuttavia, alcuni genotipi vegetali possono aumentare le risposte di difesa non specifiche all’Agrobacterium, come abbiamo osservato ad esempio per diversi genotipi di patate. Rispetto all’agroinfiltrazione, il rilevamento dell’attività AVR con agroinfezione PVX è più sensibile, più ad alto throughput negli schermi funzionali e meno sensibile alle risposte di difesa aspecifiche all’Agrobacterium. Tuttavia, può verificarsi una difesa aspecifica del PVX e c’è il rischio di perdere risposte a causa di una resistenza estrema indotta da virus. Nonostante tali limitazioni, nella nostra esperienza, l’agroinfiltrazione e l’agroinfezione PVX sono saggi adatti e complementari che possono essere utilizzati contemporaneamente per confermare i risultati l’uno dell’altro.
L’effectoromica, un approccio genomico funzionale ad alta produttività è recentemente emerso come un potente strumento per identificare igeni di resistenza (R)nelle piante coltivate e abbinare i geni di avirulenza(Avr)degli agenti patogeni1-4. In contrasto con la trasformazione stabile più dispendiosa in termini di tempo con i geni R, la strategia dell’effettoromica si basa su saggi transitori di sequenze geniche patogene.
Fin dall’era genomica, i genomi degli agenti patogeni vegetali sono stati ampiamente esplorati. Ad esempio per gli oomiceti, che includono gli agenti patogeni vegetali più devastanti, sono state generate e analizzate grandi raccolte di sequenze per geni che svolgono un ruolo durantel’interazione con la pianta 5-10. Una classe di proteine patogene rappresenta gli effettori, che manipolano la struttura e la funzione delle cellule ospiti sia per facilitare l’infezione (fattori di virulenza) sia per innescare risposte di difesa (fattori di avirulenza)11-13. L’espressione dei geni Avr nelle cellule vegetali contenenti geni R di solito si traduce nella risposta di morte cellulare ipersensibile (HR)14,15. Nella planta espressione dei geni R e Avr può essere realizzata utilizzando sistemi di espressione transitoria come Agrobacterium tumefaciens –trasformazione transitoria basata sulla base (agroinfiltrazione)16. Questa trasformazione transitoria può essere applicata anche in combinazione con sistemi di espressione virale (agroinfezione)17,18.
Per l’agroinfiltrazione, l’agente più comunemente usato è A . tumefaciens, un’ampia gamma di agenti patogeni delle piante dicot. Un tumefaciens contiene un plasmide che induce il tumore (Ti). Trasferire il DNA (T-DNA) da un plasmide Ti si trasferirà nelle cellule vegetali dopo l’attivazione del meccanismo di virulenza del batterio. Questo può essere innescato nelle cellule vegetali ferite, dai composti fenolici a basso peso molecolare rilasciati e dai monosaccaridi in un ambiente leggermente acido19. Il gene della virulenza si attiva dopo l’infiltrazione delle sospensioni dell’Agrobacterium nei pannelli fogliari definiti dalle vene maggiori. Quindi le cellule vegetali nei pannelli fogliari saranno trasformate ed esprimeranno i transgeni contenuti nella regione T-DNA.
L’agroinfezione si basa sull’Agrobatterioinoculato dalla ferita , che media la traslocazione di un virus alle cellule vegetali. Il virus si diffonde quindi ulteriormente ai tessuti vegetali adiacenti, in assenza di Agrobacterium. Per l’agroinfezione, è possibile utilizzare diversi virus vegetali. I virus dell’RNA sono vettori ideali per l’espressione genica perché possono moltiplicarsi a livelli molto alti nelle piante infette. Tra i virus dell’RNA vegetale, Potato Virus X (PVX) è ampiamente utilizzato per gli schermi di effettioromica. Per facilitare i test funzionali per un gene inserito, i vettori binari che contengono il genoma PVX affiancato dal promotore del virus del mosaico di Cavolfiore 35S e dal terminatore della nopalina sintasi, sono stati clonati nel T-DNA di A. tumefaciens20. Dopo che il T-DNA è stato trasferito in cellule vegetali, il genoma PVX contenuto nel T-DNA viene trascritto dal promotore 35S. Quindi le particelle virali si diffondono sistemicamente nelle piante infette, con conseguente espressione del gene inserito. Questo metodo basato sia sull’Agrobatterio che sul PVX è chiamato agroinfezione PVX.
Qui mostriamo esempi sia per i saggi di agroinfiltrazione che per i saggi di agroinfezione PVX. Come piante ospiti utilizziamo il germoplasma delle patate(sezione Solanum Petota), per il quale gli approcci di effettioromica sono stati pionieri e si sonodimostrati efficaci 3,4. Utilizziamo anche Nicotiana benthamiana,rinomata come impianto modello nelle piante Solanaceous 14,21,22.
Saggi transitori come l’agroinfiltrazione e l’agroinfezione sono metodi efficienti che sono vitali per la moderna ricerca sulla patologia vegetale molecolare. Nonostante alcune limitazioni, questi metodi soddisfano la domanda di analisi funzionali ad alta produttività efficienti e robuste negli impianti.
Il sistema di agroinfiltrazione è un saggio funzionale ampiamente utilizzato in una serie di specie vegetali. L’agroinfiltrazione facilita la consegna di diversi transgeni nella stessa cellula con espressione simultanea di proteine interagenti. Questo è vantaggioso per ricapitolare le relazioni R-AVR, coniando ceppi di Agrobacterium che esprimono geni Avr con ceppi che esprimono i geni R corrispondenti. Inoltre, per le coppie R-AVR note, tali coinfiltrazioni possono essere utilizzate come controlli positivi. L’inclusione di tali controlli è importante perché in alcuni genotipi dell’impianto, l’efficienza di trasformazione può essere inferiore alla soglia per rilevare le risposte. Includere controlli negativi, ad esempio un ceppo di Agrobatteri contenenti un vettore senza un inserto genico, è anche essenziale per determinare se un certo genotipo vegetale solleva risposte di difesa non specifiche all’Agrobacterium. Questa caratteristica si verifica a una certa frequenza nel germplasma delle patate, e non tutte le specie Solanum sono ben adatte per questo sistema di espressione a base di Agrobacterium. Generalmente, il saggio di agroinfiltrazione funziona molto bene in N. benthamiana e nella maggior parte dei genotipi di patate. Oltre all’effettioromica, ci sono varie altre potenziali applicazioni per la tecnica di agroinfiltrazione, come la produzione di proteine dai transgeni e la localizzazione proteica nelle cellule vegetali mediante microscopia confocale.
L’agroinfezione PVX è un sistema di screening altamente sensibile e in genere più adatto per screening ad alta produttività. Poiché l’Agrobacterium è ora presente solo localmente, le risposte non specifiche a questo batterio non sono ora molto inquietanti, poiché il virus PVX assume un’ulteriore diffusione del transgene. Tuttavia, le piante possono essere resistenti al PVX o montare risposte di resistenza estrema (ER) e in tal caso il metodo di agroinfezione non è adatto. Un’altra limitazione del metodo di agroinfezione PVX è la dimensione dell’inserto del gene di interesse. I fenotipi osservati di risposte possono variare da un’intensa necrosi nera che circonda la ferita a una debole necrosi vicino al punto di inoculazione. Sia nelle specie N. benthamiana che Solanum, l’agroinfezione PVX è riconosciuta come più sensibile dell’agroinfiltrazione.
Tenendo conto del fatto che il background genetico dei diversi genotipi vegetali testati può avere alcune restrizioni (vedi sopra), generalmente otteniamo conclusioni simili per agroinfezione PVX e agroinfiltrazione. Questi risultati sono comparabili anche come si ottengono in altri saggi, come le infiltrazioni proteiche29 ed ELISA3. Considerando i vantaggi e i limiti di entrambi i sistemi, si consiglia di utilizzare entrambi i metodi per completarsi a vicenda o confermare risultati indipendenti.
The authors have nothing to disclose.
Il lavoro è parzialmente supportato dal Wageningen University Fund (WUF), dal China Scholarship Council Program for Graduate Students e da una borsa di studio NWO-VIDI 12378.
Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
Incubator | Infors HT | Multitron II | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |