אגרואינפיציה ו- PVX agroinfection הם מבחנים תפקודיים שגרתיים לביטוי חוץ רחמי חולף של גנים בצמחים. שיטות אלה הן מבחנים יעילים באסטרטגיות אפקטאורומיות (התנגדות מהירה ותגלית גנים ארסית) וחיוניות למחקר מודרני בפתולוגיה של צמחים מולקולריים. הם עונים על הביקוש לניתוח תפקודי חזק בעל תפוקה גבוהה בצמחים.
אגרואינפיציה ו- PVX agroinfection הם שני מבחני ביטוי ארעיים יעילים לניתוח תפקודי של גנים מועמדים בצמחים. הסוכן הנפוץ ביותר עבור agroinfiltration הוא אגרובקטריום tumefaciens, פתוגן של מינים רבים של צמחי dicot. משמעות הדבר היא כי agroinfiltration יכול להיות מיושם על מיני צמחים רבים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים שלנו ואת התוצאות הצפויות בעת יישום שיטות אלה על תפוח האדמה(Solanum tuberosum),מינים הקשורים שלה נושא פקעת בר סולנום (סעיף סולנום Petota)ואת צמח המודל Nicotiana benthamiana. בנוסף לניתוח תפקודי של גנים בודדים, כגון גנים התנגדות (R) או ארסיות (Avr), בדיקת האגרואינציה מתאימה מאוד לסיכום אינטראקציות R-AVR הקשורות לאינטראקציות פתוגן מארח ספציפיות פשוט על ידי אספקת טרנסגנים R ו- Avr לאותו תא. עם זאת, כמה גנוטיפים צמחיים יכולים להעלות תגובות הגנה לא ספציפיות לאגרובקטריום, כפי שראינו למשל עבור כמה גנוטיפים תפוחי אדמה. בהשוואה לאגרו-סינון, זיהוי פעילות AVR עם אגרואינטציה של PVX רגיש יותר, בעל תפוקה גבוהה יותר במסכים פונקציונליים ופחות רגיש לתגובות הגנה לא ספציפיות לאגרובקטריום. עם זאת, הגנה לא ספציפית ל- PVX יכולה להתרחש ויש סיכון להחמיץ תגובות עקב התנגדות קיצונית הנגרמת על ידי וירוסים. למרות מגבלות כאלה, מניסיוננו, אגרואינפילטרציה ו- PVX agroinfection הם מבחנים מתאימים ומשלימים שניתן להשתמש בהם בו זמנית כדי לאשר את התוצאות אחד של השני.
Effectoromics, גישה גנומית תפקודית בעלת תפוקה גבוהה התפתחה לאחרונה ככלי רב עוצמה לזיהוי גנים עמידים (R) בצמחי יבול וגנים תואמים שלפתוגנים1-4. בניגוד לשינוי היציב שגוזל זמן רב יותר עם גנים R, אסטרטגיית ההשפעה מבוססת על מבחנים ארעיים של רצפי גנים פתוגן.
מאז עידן הגנומיקה, גנומים של פתוגנים צמחיים נחקרו באופן נרחב. לדוגמה עבור oomycetes, הכוללים את פתוגנים הצמח ההרסני ביותר, אוספים גדולים של רצפים נוצרו ונותחו עבור גנים לשחק תפקיד במהלך האינטראקציה עם הצמח5-10. מחלקה אחת של חלבוני פתוגן מייצגת אפקטים, אשר לתפעל את מבנה התא המארח ולתפקד או כדי להקל על זיהום (גורמי ארסיות) או לעורר תגובות הגנה (גורמי ארסיות)11-13. ביטוי של גנים Avr בתאי צמח המכילים גנים R בדרך כלל תוצאות תגובת מוות תא רגיש (HR)14,15. בביטוי פלנטה של גנים R ו- Avr ניתן להשיג באמצעות מערכות ביטוי ארעיות כגון אגרובקטריום tumefaciens –מבוסס טרנספורמציה חולפת (agroinfiltration)16. טרנספורמציה חולפת זו יכולה להיות מיושמת גם בשילוב עם מערכות ביטוי ויראלי (agroinfection)17,18.
עבור agroinfiltration, הסוכן הנפוץ ביותר הוא A . tumefaciens, פתוגן טווח מארח רחב של צמחי dicot. A . tumefaciens מכיל פלסמיד גרימת גידול (Ti). העברת DNA (T-DNA) מ פלסמיד Ti יהיה טרנסלוקציה לתוך תאי הצמח לאחר מכונות ארסיות של החיידק מופעל. זה יכול להיות מופעלות בתאי צמח פצועים, על ידי שוחרר במשקל מולקולרי נמוך תרכובות פנוליות monosaccharaides בסביבה חומצית מעט19. גן הארס מופעל לאחר חדירת השעיות אגרובקטריום ללוחות עלים המוגדרים על ידי ורידים גדולים. לאחר מכן תאי הצמח בלוחות העלים ישתנו ויבטאו את הטרנסג’ינים הכלולים באזור ה- T-DNA.
Agroinfection מבוסס על אגרובקטריוםמחוסן פצע , אשר מתווך טרנסלוקציה של וירוס לתאי הצמח. הנגיף מתפשט עוד יותר לרקמות צמחיות סמוכות, בהיעדר אגרובקטריום. עבור agroinfection, מספר וירוסים צמחיים ניתן להשתמש. וירוסי RNA הם וקטורים אידיאליים לביטוי גנים מכיוון שהם יכולים להתרבות לרמות גבוהות מאוד בצמחים נגועים. בין וירוסי RNA צמחיים, וירוס תפוחי אדמה X (PVX) נמצא בשימוש נרחב עבור מסכי אפקטים. כדי להקל על בדיקות תפקודיות עבור גן מוכנס, וקטורים בינאריים המכילים את הגנום PVX מוקף וירוס פסיפס כרובית 35S מקדם ואת שליחות קטלנית סינתאז nopaline, היו משובטים לתוך T-DNA של A. tumefaciens20. לאחר שה- T-DNA מועבר לתאי צמחים, הגנום של PVX הכלול ב- T-DNA מתמלל ממקדם 35S. ואז חלקיקי וירוסים מתפשטים באופן שיטתי בצמחים הנגועים, וכתוצאה מכך הביטוי של הגן שהוכנס. שיטה זו המבוססת הן על אגרובקטריום והן על PVX נקראת PVX agroinfection.
כאן אנו מציגים דוגמאות הן עבור agroinfiltration והן מבחני אגרואינדיקציה PVX. כצמחים מארחים אנו משתמשים בחיידק תפוחי אדמה (סעיףסולנום Petota),שעבורו גישות אפקטורומיקה היו חלוציות והוכחו כמוצלחות3,4. אנו משתמשים גם Nicotiana benthamiana, אשר ידוע כצמח מודל בצמחים Solanaceous 14,21,22.
מבחנים ארעיים כמו אגרואינפילטרציה ואגרואינפטיקציה הן שיטות יעילות החיוניות למחקר הפתולוגי של הצמח המולקולרי המודרני. למרות מגבלות מסוימות, שיטות אלה עונות על הביקוש לניתוח תפקודי יעיל וחזק בעל תפוקה גבוהה בצמחים.
מערכת סינון האגרו-סינון היא בדיקה תפקודית נפוצה במגוון מיני צמחים. Agroinfiltration מקל על אספקת מספר transgenes לאותו תא עם ביטוי בו זמנית של חלבונים אינטראקציה. זה יתרון עבור recapitulating R-AVR יחסים, על ידי חדירת זני אגרובקטריום המבטאים גנים Avr עם זנים המבטאים את הגנים R תואמים. כמו כן, עבור זוגות R-AVR ידועים, חדירות מטבע כאלה יכולות לשמש כפקדים חיוביים. הכללת פקדים כאלה חשובה מכיוון שבכמה גנוטיפים צמחיים, יעילות הטרנספורמציה יכולה להיות מתחת לסף כדי לזהות תגובות. כולל פקדים שליליים, למשל זן אגרובקטריום המכיל וקטור ללא תוסף גנים, הוא גם חיוני כדי לקבוע אם גנוטיפ צמח מסוים מעלה תגובות הגנה לא ספציפיות לאגרובקטריום. תכונה זו מתרחשת בתדירות מסוימת בחיידק תפוחי אדמה, ולא כל מיני סולנום מתאימים היטב למערכת ביטוי זו המבוססת על אגרובקטריום. בדרך כלל, Agroinfiltration assay עובד טוב מאוד N. benthamiana ורוב הגנוטיפים תפוחי אדמה. בנוסף לאפקטורומיקה, ישנם יישומים פוטנציאליים שונים אחרים לטכניקת סינון האגרו-סינון, כגון ייצור חלבונים בטרנגנסים ולוקליזציה של חלבונים בתאי הצמח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
PVX agroinfection היא מערכת סינון רגישה מאוד ובדרך כלל מתאימה יותר להקרנות בתפוקה גבוהה. מאז האגרובקטריום הוא עכשיו רק מקומי נוכח, תגובות לא ספציפיות לחיידק זה הם עכשיו לא מאוד מטריד, כמו וירוס PVX משתלט על התפשטות נוספת של transgene. עם זאת, צמחים עשויים להיות עמידים PVX, או לטעון התנגדות קיצונית (ER) תגובות, ובמקרה זה שיטת agroinfection אינו מתאים. מגבלה נוספת של שיטת האגרו-נדיקציה של PVX היא גודל ההוספה של גן העניין. פנוטיפים שנצפו של תגובות עשויים להשתנות מנמק שחור אינטנסיבי המקיף את הפצע לנמק קלוש ליד נקודת החיסון. בשני המינים N. benthamiana ו Solanum, אגרוין PVX מוכר רגיש יותר מאשר agroinfiltration.
אם ניקח בחשבון כי הרקע הגנטי של גנוטיפים צמחיים שנבדקו מגוונים יכול להיות כמה הגבלות (ראה לעיל), אנו בדרך כלל להשיג מסקנות דומות על ידי אגרואינדיקציה PVX ו agroinfiltration. תוצאות אלה דומות גם כפי שהושגו מבחנים אחרים, כגון חדירות חלבון29 ו ELISA3. בהתחשב ביתרונות ובמגבלות של שתי המערכות, אנו ממליצים להשתמש בשתי השיטות כדי להשלים זו את זו או לאשר תוצאות עצמאיות.
The authors have nothing to disclose.
העבודה נתמכת בחלקה על ידי קרן אוניברסיטת Wageningen (WUF), תוכנית מועצת המלגות של סין לסטודנטים לתארים מתקדמים ומענק NWO-VIDI 12378.
Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
Incubator | Infors HT | Multitron II | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |