الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية PVX هي المقايسات الوظيفية الروتينية للتعبير عن المنتبذ عابرة من الجينات في النباتات. هذه الأساليب هي المقايسات الفعالة في استراتيجيات علم الآثار (المقاومة السريعة واكتشاف الجينات avirulence) وحاسمة للبحوث الحديثة في علم الأمراض النباتية الجزيئية. وهي تلبي الطلب على تحليل وظيفي قوي عالي الإنتاجية في النباتات.
الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية PVX هما مقايستان تعبيرتان عابرتان فعالتان للتحليل الوظيفي للجينات المرشحة في النباتات. العامل الأكثر استخداما للترشيح الزراعي هو البكتيريا الزراعية tumefaciens، وهو ممرض للعديد من أنواع النباتات ديكوت. وهذا يعني أنه يمكن تطبيق الترشيح الزراعي على العديد من أنواع النباتات. هنا، نقدم بروتوكولاتنا والنتائج المتوقعة عند تطبيق هذه الطرق على البطاطا(سولانوم الدرنة)،والأنواع سولانوم البرية ذات الصلة الحاملة للدرنة(سولانوم قسم بيتوتا)والنموذج نبات نيكوتيانا بنثاميانا. بالإضافة إلى التحليل الوظيفي للجينات المفردة ، مثل المقاومة(R)أو avirulence(Avr)الجينات ، فإن فحص الترشيح الزراعي مناسب جدا لتلخيص تفاعلات R-AVR المرتبطة بتفاعلات مسببات الأمراض المضيفة المحددة بمجرد تسليم R و Avr transgenes إلى نفس الخلية. ومع ذلك، يمكن لبعض الأنماط الجينية النباتية رفع الاستجابات الدفاعية غير المحددة للبكتيريا الزراعية،كما لاحظنا على سبيل المثال للعديد من الأنماط الجينية للبطاطا. بالمقارنة مع الترشيح الزراعي ، فإن اكتشاف نشاط AVR مع العدوى الزراعية PVX أكثر حساسية ، وأكثر إنتاجية عالية في الشاشات الوظيفية وأقل حساسية للاستجابات الدفاعية غير المحددة للبكتيريا الزراعية. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث دفاع غير محدد لPVX وهناك خطر أن تفوت الاستجابات بسبب المقاومة الشديدة الناجمة عن الفيروس. على الرغم من هذه القيود، في تجربتنا، الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية PVX هي على حد سواء المقايسات المناسبة والتكميلية التي يمكن استخدامها في وقت واحد لتأكيد نتائج بعضها البعض.
Effectoromics ، وقد برز مؤخرا نهج الجينوم وظيفية عالية الإنتاجية كأداة قوية لتحديد المقاومة (R) الجينات في نباتات المحاصيل ومطابقة avirulence(Avr)الجينات من مسببات الأمراض1-4. وعلى النقيض من التحول المستقر الأكثر استهلاكا للوقت مع جينات R، تستند استراتيجية علم التأثير إلى المقايسات العابرة لتسلسلات الجينات المسببة للأمراض.
منذ عصر الجينوم، تم استكشاف جينوم مسببات الأمراض النباتية على نطاق واسع. على سبيل المثال بالنسبة للوميسيتات ، والتي تشمل مسببات الأمراض النباتية الأكثر تدميرا ، تم إنشاء مجموعات كبيرة من التسلسلات وتحليلها للجينات التي تلعب دورا أثناء التفاعل مع النبات5-10. فئة واحدة من البروتينات المسببة للأمراض يمثل التأثيرات، والتي تعالج بنية الخلية المضيفة ووظيفة إما لتسهيل العدوى (عوامل الفوعة) أو لتحريك الاستجابات الدفاعية (عوامل avirulence)11-13. التعبير عن الجينات Avr في الخلايا النباتية التي تحتوي على الجينات R عادة ما يؤدي إلى استجابة موت الخلايا مفرط الحساسية (HR)14,15. في بلانتا التعبير عن الجينات R وAVR يمكن أن يتحقق باستخدام أنظمة التعبير عابرة مثل Tumefaciens Agrobacterium –التحول العابر القائم (الترشيح الزراعي)16. ويمكن أيضا تطبيق هذا التحول عابرة في تركيبة مع نظم التعبير الفيروسي (agroinfection)17,18.
بالنسبة للترشيح الزراعي ، فإن العامل الأكثر استخداما هو A. tumefaciens ، وهو مجموعة واسعة من مسببات الأمراض في نباتات الديكوت. يحتوي التوميفاسيان على بلازميد (Ti) مثير للورم. نقل الحمض النووي (تي الحمض النووي) من تي بلازميد سوف تنتقل إلى الخلايا النباتية بعد تنشيط آلية فحولة البكتيريا. ويمكن أن يحدث هذا في الخلايا النباتية الجرحى, من قبل المركبات الفينولية منخفضة الوزن الجزيئية الصادرة وmonosaccharaides في بيئة حمضية قليلا19. يتم تنشيط جين الفوعة بعد تسلل تعليق Agrobacterium إلى ألواح أوراق تحددها الأوردة الرئيسية. ثم سيتم تحويل الخلايا النباتية في لوحات ورقة والتعبير عن transgene (ق) الواردة في منطقة تي الحمض النووي.
ويستند العدوى الزراعية على Agrobacteriumتلقيح الجرح ، الذي يتوسط نقل الفيروس إلى الخلايا النباتية. ثم ينتشر الفيروس إلى الأنسجة النباتية المجاورة ، في غياب Agrobacterium. بالنسبة للإصابة الزراعية، يمكن استخدام العديد من الفيروسات النباتية. فيروسات الحمض النووي الريبي هي ناقلات مثالية للتعبير الجيني لأنها يمكن أن تتضاعف إلى مستويات عالية جدا في النباتات المصابة. من بين الفيروسات الحمض النووي الريبي النباتية، يستخدم على نطاق واسع فيروس البطاطا X (PVX) لشاشات علم التأثير. لتسهيل الاختبارات الوظيفية لجين إدراجها، تم استنساخ ناقلات ثنائية التي تحتوي على الجينوم PVX يحيط بها فيروس القرنبيط الفسيفساء 35S المروج والمنهي synthase nopaline، في T-DNA من A. tumefaciens20. بعد نقل الحمض النووي إلى خلايا نباتية ، يتم نسخ جينوم PVX الموجود في الحمض النووي T من مروج 35S. ثم تنتشر جزيئات الفيروس بشكل منهجي في النباتات المصابة ، مما يؤدي إلى التعبير عن الجين المدرج. وتسمى هذه الطريقة على أساس كل من Agrobacterium وPVX PVX العدوى الزراعية.
هنا نعرض أمثلة لكل من الترشيح الزراعي ومقاايسات العدوى الزراعية PVX. كما النباتات المضيفة نستخدم الجرثومة البطاطا (قسم سولانوم بيتوتا)،والتي نهج علم التأثير كانت رائدة وثبت نجاحها3،4. ونحن نستخدم أيضا نيكوتيانا بنثاميانا، والتي تشتهر بأنها مصنع نموذجي في النباتات سولاناسيوس 14،21،22.
المقايسات العابرة مثل الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية هي طرق فعالة حيوية لأبحاث علم الأمراض النباتية الجزيئية الحديثة. على الرغم من بعض القيود، تلبي هذه الأساليب الطلب على تحليل وظيفي عالي الإنتاجية وفعال وقوي في النباتات.
نظام الترشيح الزراعي هو المقايسة الوظيفية المستخدمة على نطاق واسع في مجموعة من الأنواع النباتية. يسهل الترشيح الزراعي تسليم العديد من المتحولين إلى نفس الخلية مع التعبير المتزامن عن البروتينات المتفاعلة. هذا مفيد لتلخيص العلاقات R-AVR، من خلال سلالات Agrobacterium coinfiltrating التي تعبر عن جينات Avr مع السلالات التي تعبر عن الجينات R مطابقة. أيضا، لأزواج R-AVR المعروفة، يمكن استخدام مثل هذه اللترات كعناصر تحكم إيجابية. ومن المهم إدراج هذه الضوابط لأن كفاءة التحويل في بعض الأنماط الجينية النباتية يمكن أن تكون دون العتبة للكشف عن الاستجابات. بما في ذلك الضوابط السلبية ، على سبيل المثال سلالة Agrobacterium التي تحتوي على ناقل دون إدراج الجينات ، أمر ضروري أيضا لتحديد ما إذا كان نوع وراثي نباتي معين يثير استجابات دفاعية غير محددة للبكتيريا الزراعية. تحدث هذه الميزة على تردد معين في جرثومة البطاطس ، وليس كل أنواع سولانوم مناسبة تماما لنظام التعبير القائم على Agrobacterium. عموما، يعمل المقايسة الترشيح الزراعي بشكل جيد جدا في N. بنثاميانا ومعظم الأنماط الجينية البطاطا. بالإضافة إلى علم التأثير، هناك تطبيقات محتملة أخرى مختلفة لتقنية الترشيح الزراعي، مثل إنتاج البروتينات من المتحولين جنسيا وتوطين البروتين في الخلايا النباتية عن طريق المجهر الكونفوجال.
PVX agrofection هو نظام فحص حساس للغاية وعادة ما يكون أكثر ملاءمة للفحوصات عالية الإنتاجية. وبما أن البكتيريا الزراعية موجودة الآن محليا فقط، فإن الاستجابات غير المحددة لهذه البكتيريا ليست مزعجة للغاية الآن، حيث أن فيروس PVX يتولى المزيد من انتشار المتحولين جنسيا. ومع ذلك، قد تكون النباتات مقاومة ل PVX، أو جبل المقاومة القصوى (ER) الاستجابات، وفي هذه الحالة طريقة العدوى الزراعية ليست مناسبة. وثمة قيد آخر على طريقة الإصابة الزراعية PVX هو إدراج حجم الجين المثير للاهتمام. قد تختلف الأنماط الظاهرية الملاحظة للاستجابات من نخر أسود شديد يحيط بالجرح إلى نخر خافت بالقرب من بقعة التطعيم. في كل من N. بنثاميانا وسولانوم الأنواع، ومن المسلم به PVX العدوى الزراعية باعتبارها أكثر حساسية من الترشيح الزراعي.
مع الأخذ في الاعتبار أن الخلفية الوراثية للأنماط الجينية النباتية المتنوعة التي تم اختبارها يمكن أن يكون لها بعض القيود (انظر أعلاه) ، نحصل بشكل عام على استنتاجات مماثلة من قبل PVX العدوى الزراعية والترشيح الزراعي. هذه النتائج هي أيضا قابلة للمقارنة كما تم الحصول عليها في المقايسات الأخرى، مثل تسلل البروتين29 و ELISA3. وبالنظر إلى مزايا والقيود المفروضة على كلا النظامين، نوصي باستخدام كلتا الطريقتين إما لاستكمال بعضهما البعض أو تأكيد النتائج المستقلة.
The authors have nothing to disclose.
ويدعم هذا العمل جزئيا صندوق جامعة واغنينغن، وبرنامج مجلس المنح الدراسية الصيني لطلاب الدراسات العليا، ومنحة NWO-VIDI 12378.
Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
Incubator | Infors HT | Multitron II | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |