Summary

Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

Published: November 01, 2013
doi:

Summary

Degranulação dos mastócitos, a liberação de mediadores alérgicos, é importante para alergia, asma e defesa do parasita. Aqui demonstramos uma técnicas para a avaliação dos efeitos de drogas e de substâncias tóxicas em desgranulação, a metodologia utilizada recentemente para expor o efeito inibidor potente do agente antibacteriano triclosano 2.

Abstract

Os mastócitos desempenham um papel importante na doença alérgica e de defesa imunológica contra parasitas. Uma vez activado (por exemplo, por um alérgeno), eles desgranulam, um processo que resulta na exocitose de mediadores alérgicos. Modulação da desgranulação dos mastócitos por drogas e substâncias tóxicas podem ter efeitos positivos ou negativos sobre a saúde humana. Função de mastócitos foi dissecada em pormenor com a utilização de mastócitos de leucemia basófilas de rato (RBL-2H3), um modelo amplamente aceito de mastócitos das mucosas humanas 3-5. Componente de mastro de células granulares e o mediador alérgica β-hexosaminidase, que é libertado de forma linear em conjunto com a histamina dos mastócitos 6, pode ser facilmente e confiantemente ser medido por meio de reacção com um substrato f luorogénico, obtendo-se a intensidade de fluorescência mensurável num ensaio de microplacas que é passível de estudos de alto rendimento 1. Originalmente publicado por Naal et al. 1, que se adaptaram este ensaio degranulação para a triagem of drogas e substâncias tóxicas e demonstrar seu uso aqui.

Triclosan é um agente antibacteriano de largo espectro, que está presente em muitos produtos de consumo e foi encontrado ser uma ajuda terapêutica na doença alérgica da pele humana 7-11, embora o mecanismo deste efeito é desconhecido. Aqui demonstramos um ensaio para o efeito do triclosan sobre a desgranulação de mastócitos. Mostramos recentemente que triclosan afeta fortemente a função dos mastócitos 2. Em um esforço para evitar a utilização de um solvente orgânico, o triclosan é dissolvida directamente em tampão aquoso com calor e agitação, e a concentração resultante é confirmado por espectrofotometria de UV-Vis (usando ε 280 = 4,200 L / M / cm) 12. Este protocolo tem o potencial para ser usado com uma variedade de produtos químicos para determinar os seus efeitos sobre a desgranulação de mastócitos e, mais genericamente, o seu potencial alérgico.

Introduction

Os mastócitos são altamente granulado células imunes efetoras que servem como mediadores importantes na asma, alergias, parasitas defesa e carcinogênese 13-16. Eles residem em quase todos os tecidos vascularizados 15, onde armazenar com segurança os mediadores inflamatórios e alérgicos em grânulos citoplasmáticos até ser ativado para desgranulam. Degranulação é a exocitose de grânulos à membrana, o que resulta na liberação de mediadores farmacologicamente ativos, tais como a histamina, triptase, leucotrienos e 15. Este processo resulta na iniciação de reacções de hipersensibilidade do tipo I, que são críticas para a montagem de defesa contra parasitas bem como o início de reacções alérgicas, asma, e 15 cancerígenas.

Os mastócitos e basófilos, FceRI expressam receptores, os receptores de alta afinidade para a imunoglobulina E (IgE) 17. A exposição a um alergénio ou antigénio provoca a agregação de múltiplos receptores de IgE FceRI ligados 17, e é este so-chamada "reticulação" de receptores Fc de IgE ligadas, que inicia o processo de desgranulação: uma cascata de acontecimentos de fosforilação de tirosina, a activação de fosfolipase C, o efluxo de cálcio das reservas internas, e influxo de cálcio para dentro da célula 18. Este influxo de cálcio é necessária para a desgranulação e, ainda, sinaliza a fusão com a membrana dos grânulos antes de causar a exocitose de grânulos 15. Experimentalmente, um ionóforo de cálcio pode ser utilizada para transporte de cálcio directamente através da membrana da célula 19, o que evita essencialmente todas as etapas de transdução de sinal, antes da etapa 20 do influxo de cálcio, permitindo a identificação de um alvo por via de um tóxico como estando a montante ou a jusante de cálcio de sinalização 20.

Degranulação pode ser medido de forma rápida e eficaz, o controlo da libertação de β-hexosaminidase no sobrenadante de células, que é libertada a partir dos grânulos de forma linear juntamente com a histamina 6, mas ié muito mais fácil de detectar utilizando uma reacção enzima-substrato simples e um leitor de microplacas para análise do produto fluorescente. Este ensaio de microplacas, como descrito na secção do protocolo, baseia-se num método robusto originalmente desenvolvida por Naal et ai. 1, que quantifica a clivagem do substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-N-acetil–D-β glucosaminide por β- hexosaminidase. Nós modificamos o ensaio para efeitos de teste de drogas e substâncias tóxicas, com triclosan destaque aqui. Este método quantifica fiável desgranulação, é uma alternativa de baixo custo para, por exemplo, o fluxo de métodos de detecção baseados em citometria de 21, e tem o potencial de se prestar bem para rastreio de alto rendimento de uma grande variedade de fármacos anti-alérgicos, assim como imunotóxicas ou substâncias químicas alergênicas. Este último ponto é particularmente importante, tendo em conta o relatório do Conselho Nacional de Pesquisa 2007 "Ensaios de Toxicidade no Século 21: Uma visão e uma StratEGY "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), que preconiza para o desenvolvimento de testes de toxicologia de alto rendimento que utilizam a cultura de células para reduzir a utilização dispendiosa de animais tradicionais, tais como ratinhos de laboratório. O protocolo desenvolvido pela desgranulação Naal et ai. 1, e modificada por nós 2, utiliza a linha de células RBL-2H3, que é um modelo bem aceite homóloga aos mastócitos das mucosas humanas ou basófilos 3-5. (Métodos para a cultura de células RBL-2H3 estão detalhados em Hutchinson et al. 22). Este ensaio poderia provavelmente ser adaptado a qualquer tipo de célula mastro em anexo.

Triclosan (TCS) é um antimicrobiano de amplo espectro que tem sido utilizado por mais de 30 anos em hospitais, produtos de cuidados pessoais e de bens de consumo 23,24. O modo de ação para a característica antimicrobiana da TCS é a inibição da biossíntese de ácidos graxos, provavelmente inibindo enoil-acilproteína transportadora reductase 25,26. É encontrado em todo o mundo em uma ampla gama de produtos de consumo, tais como gel de banho, loção para as mãos, creme dental, enxaguatório bucal, e na mão sabonetes em concentrações de até 0,3% ou 10 mM 24. O uso generalizado de TCS resultou em níveis detectáveis ​​em humanos 27-29 e em rios e córregos 30. Um estudo feito pela Allmyr et al. 27 demonstraram que a TCS e seus metabólitos estão presentes tanto no plasma e no leite de mães que amamentam. Importante, a TCS é facilmente absorvido pela pele 31-37. Queckenberg et ai. Encontrado 37 ~ 10% a absorção de um ~ 70 mM TCS creme na pele humana, dentro de 12 horas, resultando em uma concentração significativa na pele, onde residem os mastócitos.

SCT foi demonstrado clinicamente para controlar a doença alérgica da pele humana 7-11, mas o mecanismo pelo qual a TCS alivia as doenças alérgicas de pele tem sido desconhecido 38. Usando o ensaio de fluorescência de microplacas detailed neste vídeo, demonstramos recentemente que a TCS, a concentrações tão baixas quanto 2 uM, atenua significativamente a função de mastócitos e desgranulação, proporcionando uma potencial explicação para estes dados clínicos 2. Além de proporcionar uma explicação para estes dados clínicos, os nossos resultados em Palmer et al. 2 sugerem que a TCS de sinalização tem como alvo a jusante das moléculas do influxo de cálcio. Devido à importância da sinalização de cálcio em muitos outros processos imunológicos e biológicos, a TCS poderia ter efeitos adversos sobre uma ampla variedade de processos biológicos necessários. Na verdade, Udoji et al. 39 mostrou que TCS suprime a atividade das células natural killer humano lítico, outra função imune inato importante.

Para além do seu potencial como uma ajuda terapêutica na doença alérgica da pele (ou, inversamente, como um immunotoxicant), TCS também pode ser um disruptor endócrino 40-49. Assim, um procedimento claro de como preparar este produto químico em solução is de interesse para os toxicologistas. Porque SCT é uma pequena molécula hidrófoba, os veículos orgânicos são muitas vezes utilizados para torná-lo mais solúvel em água. Na maioria dos estudos de toxicidade em que a TCS foi testado, a preparação envolveu a dissolução em água com o auxílio de um solvente orgânico tal como etanol, acetona, ou óleo 2,50,51. No entanto, muitas vezes esses solventes são biologicamente ativa-se, complicando assim a interpretação da substância em estudo de dados 51. Na verdade, de acordo com Rufli et al. 52 e outros 53, recomenda-se que as soluções de ensaio para ensaios de toxicidade aquática são preparadas utilizando métodos físicos sobre os métodos químicos, devido ao potencial de solventes químicos para criar artefactos de toxicidade. Nós mostramos anteriormente que a TCS dissolvido em 0,24% de etanol / água (v / v) e sonicado por 30 min amortece RBL degranulação dos mastócitos 2. O etanol em concentrações mais elevadas do que 0,24% foi mostrado para amortecer degradação mastócitoscanulação 54,55, exemplos dos efeitos potencialmente de confusão de solventes orgânicos em estudos de toxicidade.

Não só é importante ter em conta o efeito de solventes no organismo ou células utilizadas para o estudo, mas também é importante para monitorizar o efeito de um solvente sobre o próprio produto químico de teste. Por exemplo, Skaare et ai. Dissolvendo 51 descobriram que a TCS em polietileno-glicol (normalmente encontrados nos dentífricos e bochechos) atenuou os efeitos anti-bacterianos e anti-placa em mulheres saudáveis ​​do sexo feminino durante a dissolução em óleos provocou uma perda completa de função. Portanto, a capacidade de diferentes solventes para modular tóxico e de drogas, incluindo TCS, efeitos devem ser considerados no desenho do ensaio. A utilização de óleos ou aditivos de sabor pode interferir com os efeitos de TCS em vários produtos 50,51.

Num esforço para eliminar a necessidade de utilizar solventes orgânicos, que melhorado para o nosso método de dissolução TCS 2, eliminando o uso de um sol orgânicadesabafar. No presente protocolo, dissolver TCS grânulos diretamente em tampão aquoso com o calor (≤ 50 ° C) e, em seguida, verificar a concentração desse estoque TCS por espectrofotometria de UV-Vis. Estas melhorias são possíveis porque SCT é solúvel em água até 40 uM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) e tem sido demonstrado que resistem à degradação quando aquecido a 50 ° C ( http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. Também tem a vantagem de espectrofotometria de UV-Vis, como TCS também é conhecido por absorvem fortemente a 280 nm, com um 58 coeficiente de extinção molar de 4,200 L / mol / cm 12.

Este protocolo oferece uma maneira simples, mas eficaz para dissolver TCS grânulos para um tampão, sem o auxílio de um solvente orgânico, incluindo o baixo custo e rápida verificaçãode concentração e descreve um ensaio de microplaca fluorescente poderoso para monitorar os efeitos químicos sobre a degranulação dos mastócitos.

Protocol

Note-se que todas as receitas tampão são incluídas numa tabela no final do texto do protocolo. DIA 1: 1. Preparação de Células Planeje 96 poços esquema de configuração da placa, centrando-se amostras no layout, a fim de evitar efeitos de borda. Atribuir três repetições para cada concentração testada TCS (± desgranulação estimulante de antigénio ou ionóforo), bem como triplicados para a libertação espontânea (sem estimu…

Representative Results

Quando aquecida a 50 ° C durante 90 min, o espectro de absorção de UV-Vis de SCT produz uma curva forte, suave entre ~ 260 e 300 nm, com pico a 280 nm, como mostrado na Figura 1. Espectrofotometria de UV-Vis, portanto, é uma importante ferramenta que pode ser utilizada para calcular a concentração, uma vez que o coeficiente de absorção molar publicada a 280 nm é de 4.200 L / mol / cm 12. Nós descobrimos que a TCS não cai para fora da solução durante o período de tempo de todo o experimento desgranul…

Discussion

Em 2004, Naal et ai. Uma desenvolveu um biossensor de mastócitos para o ensaio de elevado rendimento de degranulação. É um ensaio robusto que nós adaptamos para os nossos estudos TCS e detalhado neste vídeo. Antes da Naal et ai. Ensaio 1, a desgranulação dos mastócitos foi avaliada rotineiramente através β-hexosaminidase 59-61, mas estes métodos iniciais utilizados fluorímetros no qual uma amostra foi lido ao mesmo tempo. Importante, Naal et al. concordância directa e…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

LMW e RHK são suportados pela Escola de Pós-Graduação da UMaine de Ciências Biomédicas e Engenharia (GSBSE); RHK também foi apoiado pelo Fundo Maine & Estação Experimental Forest. Financiamento adicional foi fornecido pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIH P20-GM103423), o Agricultural Maine & Estação Experimental Florestal (Grant Número ME08004-10, JAG), a Universidade de Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) e um Research Grant Iniciado em Farmacologia / Toxicologia da PhRMA fundação (JAG). Agradecemos drs. David Holowka e Barbara Baird para o antigénio e células. Somos gratos a Hina Hashmi, Alejandro Velez e Andrew Abovian ajuda com equipamentos e ordens. Este é Maine Agricultural & Estação Experimental Floresta número de publicação 3311.

Materials

RBL-2H3 Cells

ATCC

CRL-2256

The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC

Triclosan/Irgasan

Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

Should be stored in a low humidity environment

Trypsin

Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

Lonza

12-611F

Fetal Bovine Serum

Atlanta Biologicals

S11150

Gentamycin Sulfate

Lonza Biological Sciences

17-518

Albumin, Bovine Serum

Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)

Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

Magnesium Chloride

VWR

BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucose

Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

Potassium Chloride Crystal

J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

Calcium chloride dihyrdate

Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glycine

Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)

EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

Wrap in foil – is light-sensitive

Anti-DNP Mouse IgE

Sigma

D8406

Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.

DNP-BSA

Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University

Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018

Calcium Ionophore A23187

Sigma

C75-22-1mg

Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C

Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully

DMSO

Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

Acetic Acid

VWR

BDH3094-2

CAS# 64-19-7

Anhydrous Sodium Carbonate

Sigma

222321

CAS# 497-19-8

Sodium Chloride

Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

Hydrochloric Acid

VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

Reference Buffer, pH 7

VWR

BDH5046

Reference Buffer, pH 10

VWR

BDH5072

Reference Buffer, pH 4

VWR

BDH5018

pH electrode storage solution

VWR

14002-828

Equipment:

Material Name

Company

Catalogue Number

Comments (optional)

DU 7500 Spectrophotometer

Beckmann

No longer sold

Synergy 2 plate reader

Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software

BioTek

Module S

Hematocytometer

Hausser Scientific

3110

7 x 7 CER HOT/STIR 120 V

Combination hot plate/magnetic stir plate

VWR

97042-634

Centrifuge

Eppendorf

5430

Tissue culture water bath

VWR

Model# 89032-206

Tissue Culture biological safety cabinet

SafeGARD (TC hood)

The Baker Company

Model# SG403A-HE

Tissue culture incubator

ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

VWR

Range: P2-P1000

Balance

Mettler Toledo

Model# AG204

pH meter

Symphony/VWR

Model# SB70P

Pipet-Aid

Drummond Scientific

4-000-100

Combitip dispenser

Eppendorf

4981 000.019

Recipes:

Name

Recipe

Notes

Acetate Buffer, pH 4.4

  • Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH.
  • This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water:

(1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml

Sterile Filter into autoclaved glass bottle

Substrate (4-MU)

  • Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4)
  • Store in -20°C
  • Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again

For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer

Glycine Carbonate Buffer, pH 10

  • 26.7 g glycine
  • 47.1 g anhydrous sodium carbonate
  • Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10

Sterile filter into autoclaved glass bottle

Tyrodes (2 L), pH 7.4

  • 135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M)
  • 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock
  • 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock
  • 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock
  • 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M)
  • 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock
  • Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4

Sterile filter into autoclaved glass bottle

RBL Cell Media

  • Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath
  • Follow standard sterile technique
  • Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts)
  • Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS
  • Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette
  • Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.

Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle

Plastic material used:

Material Name

Company

Catalogue Number

Type of Plastic

200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack

VWR

53509-009

polypropylene

1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery

VWR

89003-420

polyethylene

10 µl micro tip low binding sterile

VWR

14217-704

polypropylene

Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force

VWR

20170-038

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps

VWR

21008-178

polypropylene

Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps

VWR

21008-103

polypropylene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap

Greiner Bio One

690175

polystyrene

CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap

Greiner Bio One

658175

polystyrene

CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

Greiner Bio One

607180

polystyrene

CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

Greiner Bio One

710180

polystyrene

CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette

Greiner Bio One

606180

polystyrene

CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette

Greiner Bio One

760180

polystyrene

1 cm cuvettes

N/A

N/A

polystyrene

CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid

96-well Plate

Greiner Bio One

655086

polystyrene

Combitips

Eppendorf

022266501

Polypropylene/

polyethylene

Referenzen

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Weatherly, L. M., Kennedy, R. H., Shim, J., Gosse, J. A. A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent. J. Vis. Exp. (81), e50671, doi:10.3791/50671 (2013).

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