Artikeln beskriver en metod för framställning av ett acellulärt matris från råtta tarmen. Härledningen av tarm byggnadsställningar är viktigt för framtida tillämpningar inom tissue engineering, stamcellsbiologi och drogtestning.
Framgångsrika vävnadsteknik involverar kombination av ställningar med lämpliga celler in vitro eller in vivo. Ställningar kan vara syntetisk, naturligt framställda eller härrör från vävnader / organ. De senare erhålls genom att använda en teknik som kallas decellularization. Decellularisering kan involvera en kombination av fysikaliska, kemiska och enzymatiska metoder. Målet med denna teknik är att ta bort alla mobil spår samtidigt som den makroekonomiska och mikroarkitektur av den ursprungliga vävnaden.
Tarmvävnadsteknik har hittills använt relativt enkla byggnadsställningar som inte reproducerar den komplexa arkitekturen av den infödda orgel. Fokus för denna uppsats är att beskriva en effektiv decellularization teknik för råtta tunntarmen. Isoleringen av tunntarmen, för att se till att upprätthålla en kärlanslutning beskrivs. Den kombination av kemiska och enzymatiska lösningar för att avlägsna cellerna whilst bevara villus-crypt axeln i luminala aspekten av ställningen också anges. Slutligen är utvärdering av producerade ställningar för lämpliga egenskaper diskuteras.
Tissue engineering (TE) ger ett terapeutiskt alternativ till organtransplantation, förbi frågor om immunosuppression och organbristen. TE har nyligen haft framgångsrika tillämpningar inom kliniken, med utbyte av organ såsom urinblåsa 1, urinröret 2 och luftstrupe, både hos vuxna 3,4 och barn 5.
Att bygga ett vävnadstekniska organ kräver en kombination av en byggnadsställning med lämpliga celler. Hängställning kan framställas med hjälp av naturligt härledda (t.ex. kollagen) och syntetisk (t ex poly-L-glykolsyra; PLGA) material, eller erhållas genom decellularisering av nativa organ och vävnader. Ställningar som har använts hittills för intestinal TE har huvudsakligen varit antingen decellulariserade (liten intestinal submucosa) eller syntetiska (poly-L-glykolsyra och poly-mjölksyra) 6-13. Dessa biomaterial är mycket enkla i både makro-och mikroarkitektur, somkanske inte är perfekt om vävnadstekniska tarmen ska kliniskt översättas. En optimal biomaterial för tarmen bör ha en medfödd vaskulär träd som kan anslutas till värdblodtillförsel, en stegvis rörformig vägg med olika egenskaper för att reflektera skikten i tarmväggen och ett villus-crypt axel på den luminala sidan till stöd med återplantering av epitelceller stamceller.
Decellularization är en ny metod som producerar ställningar genom att avlägsna celler från hela organ samtidigt som deras ursprungliga arkitekturen 14. Detta är att föredra för att redan existerande ställningar eftersom de inte bara replikera struktur av organet, utan också innehålla kemiska signaler inbäddade i den extracellulära matrisen (ECM) som stöd cellulär proliferation och differentiering. Under 2008 avliden luftstrupe var decellulariseras 14 seedade med patientens egna celler, och transplanteras för att ersätta de viktigaste vänster bronker i en ung man <sup> 3. Sedan dess har ett antal grupper rapporterade produktionen av decellulariserade byggnadsställningar för hjärtat 15, lever 16,17, och lunga 18-20 i små och stora djur.
Vi har också anpassat samma metod för att producera en liten tarm decellulariserad byggnadsställning 21. Målet med den här beskrivna metoden är att framställa decellulariserade intestinala matriser som upprätthåller de makroskopiska egenskaperna hos den ursprungliga vävnaden, såsom blodtillförseln, såväl som den mikroskopiska strukturen för villus-crypt axel i intestinala lumen. Vi tror att denna metod skulle i sista hand antas för andra organ för att förbättra effektiviteten i decellularisering.
De svåraste stegen i att inrätta detta experiment involverar kanylering av SMA och upprättande och upprätthållande av sterilitet. Kanyle SMA i gnagare utan att sprängas sönder väggen kan vara ganska svårt på grund av storleken och fartygets position. Alternativt kan en sutur placeras runt den proximala aorta före ursprung SMA, följt av kanylering av aorta sig distalt, rikta kanylen i SMA. Under decellularization en kombination av dålig kanyl placering och höga flöden kan resultera i att förlora den vaskulära tillgång. Sterilitet är en viktig fråga på grund av den mängd av bakteriefloran som är närvarande i tunntarmen. Tvättning med PBS / AA följande skörd är mycket viktigt, och något tecken på fekalt material eller skräp måste avlägsnas från lumen. Placering av en del av byggnadsställningen i ett Falcon-rör med DMEM i inkubatorn efter UV-sterilisering bör vara en indikator om sterilitet har uppnåtts. I falletav bakteriell kolonisering, kommer media ändra pH med sin färg vända från rött till gult. För att hantera detta krävs ytterligare UV cykler rekommenderas samt tvättning med PBS som innehåller en hög koncentration av antibiotika / antimykotika.
En möjlig modifikation för att erhålla en byggnadsställning med både kärl och venkateter skulle vara att kanylera nedre hålvenen (IVC) samt SMA. Decellularization från de venösa och kärl sidor bör prövas intermittent för alla tre lösningar. Kontinuerlig decellularization kan brista kapillärerna genom att ha positivt tryck på båda sidor.
Under åren har det funnits ett antal insatser i tarm TE med olika cell-ställningskombinationer in vitro och in vivo 6,9,12. Huvuddelen av arbetet har utförts med hjälp av rörformiga nonwoven 95% PGA-5% PLGA byggnadsställningar belagda med kollagen typ I 6,7,13,22. Efter sådd med tarmepithelial organoid enheter (OU) och en period om implantation i omentum hos möss bildar de cystor med muskel på utsidan och epitel på insidan som sedan kan tubularized. Emellertid porositeten och enkelhet i konstruktionen av dessa ställningar inte tillåta för generering av stora bitar av artificiell tarm i en in vitro-miljö som den i en bioreaktor. Dessutom har avsaknaden av en medfödd vaskulär nätverk som kan vara ansluten till mottagaren ytterligare begränsar användningen av denna byggnadsställning för klinisk översättning. Förutom de experiment med PGA-PLGA scaffolds har andra grupper användes kollagen eller SIS-ställningar, vilka båda inte replikerar intrikat av tarmkanalen. SIS i synnerhet är den enda tidigare publicerade metoden av tarmvävnadsteknik och har använts i mer än 150 medicinska inställningar, visar förmåga decellulariserade byggnadsställningar för att ge mekanisk stabilitet och främja celltillväxt, medan blyning till ingen immunogent svar. Men bristen på lämpliga makro-och mikro-arkitektur, har lett till dåliga resultat i sin "används för tarm TE ändamål 9-11,23.
Fördelarna med decellularization metodik vi har beskrivits innefattar bevarandet av mikroskopiska egenskaper såsom den luminala kryptan-villus arkitektur som utgör en lämplig miljö för återplantering av tarm stamceller nisch. I makroskopiska aspekten, kommer närvaron av en hierarkisk vaskulära nätverket möjliggöra fastsättning till mottagaren, vilket möjliggör tillhandahållande av näringsämnen och syre till alla skikt av det TE-armen 21. Vad mera är, har upprätthållandet av ECM-komponenter, såsom kollagen, elastin och glyocosaminoglycans en viktig roll, inte bara med avseende på mekaniska egenskaper utan även styra cellulär proliferation och differentiering. Viktigast förmåga decellularization metod som ska skalas upp till storar vävnader samtidigt bibehålla samma egenskaper är en viktig egenskap för klinisk översättning av TE.
Utvecklingen av en naturlig tarm matris med en vaskulär nätverk möjliggör skapandet av större segment av konstgjord tarm som kan anslutas till värden.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Wake Forest Institute of regenerativ medicin för deras hjälp med utvecklingen av detta protokoll. Vi erkänner stöd genom bidrag från Great Ormond Street Hospital välgörenhet, stiftelsen Eugenio Litta (Genève, Schweiz), Vetenskapsrådet, Royal College of Surgeons i England, de Sparks Barnens Medical Charity, det brittiska utrikesdepartementet för Storbritannien / USA Stamcells Collaboration Award och Mittal forskningsfonden. Vi vill också tacka Royal Society / Wolfson stiftelsen för tissue engineering laboratorium renovering bidrag som erhållits för Barnkirurgiska avdelningen vid Institute of Child Health. PDC och SE stöds av Great Ormond Street Hospital Barnens välgörenhet.
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
Sodium chloride | |||
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |