O artigo descreve um método para a produção de uma matriz acelular a partir de intestino de rato. A derivação de andaimes intestinal é importante para futuras aplicações em engenharia de tecidos, biologia das células estaminais e testes de drogas.
Engenharia de tecidos bem sucedido envolve a combinação de andaimes com células adequadas in vitro ou in vivo. Os andaimes podem ser sintéticos, de origem natural ou derivados de tecidos / órgãos. Estes últimos são obtidos utilizando uma técnica chamada de descelularização. Descelularização pode envolver uma combinação de métodos enzimáticos física, química, e. O objetivo desta técnica é remover todos os vestígios de telefonia celular, mantendo a arquitetura micro-macro e do tecido original.
Engenharia de tecidos intestinais, até agora utilizados andaimes relativamente simples que não reproduzem a arquitetura complexa do órgão nativo. O foco deste artigo é descrever uma técnica eficiente para decellularization rato intestino delgado. O isolamento do intestino delgado, de modo a assegurar a manutenção de uma ligação vascular é descrito. A combinação das soluções químicas e enzimáticas para remover as células whilª preservando o eixo vilosidade-cripta no aspecto luminal do andaime também está definido para fora. Finalmente, é discutida a avaliação de andaimes produzidos para as características apropriadas.
A engenharia de tecidos (TE) oferece uma alternativa terapêutica ao transplante de órgãos, ignorando questões de imunossupressão e escassez de órgãos. TE teve, recentemente, aplicações bem sucedidas na clínica, com a substituição de órgãos como a bexiga 1, 2 uretra e traquéia, tanto em adultos 3,4 e crianças 5.
Construção de um órgão de engenharia de tecidos, requer a combinação de um andaime, com as células apropriadas. Um andaime pode ser preparado usando de origem natural (por exemplo, colagénio) e (por exemplo, ácido poli-L-glicólico; PLGA) sintética materiais, ou ser obtido através da descelularização de órgãos e de tecidos nativos. Os andaimes que têm sido utilizados até agora para TE intestinais têm sido principalmente quer descelularizado (submucosa de intestino delgado) ou sintético (ácido poli-L-ácido glicólico e ácido poli-láctico) 6-13. Estes biomateriais são muito simples, tanto macro-e micro-arquitetura, quepode não ser ideal se intestino engenharia de tecidos deve ser traduzido clinicamente. Um biomaterial ideal para o intestino deve ter uma árvore vascular inata, que pode ser conectado ao fornecimento de sangue do hospedeiro, de uma parede tubular de camadas com diferentes propriedades de modo a reflectir as camadas da parede intestinal e um eixo vilo-cripta no lado luminal para auxiliar com repovoamento de células estaminais epiteliais.
Decelularização é uma nova metodologia que produz andaimes, removendo as células de órgãos inteiros, mantendo sua arquitetura original 14. Isto é preferível para andaimes já existente, uma vez que não só a mesma estrutura do órgão, mas também contêm sinais químicos incorporados no interior da matriz extracelular (ECM), que ajuda a proliferação e diferenciação celular. Em 2008, um traquéia cadavérico foi descelularizados 14, semeado com células do próprio paciente, e transplantadas para substituir brônquio principal esquerdo em um homem jovem <sup> 3. Desde então, diversos grupos relataram a produção de andaimes descelularizados para o coração 15, 16,17 fígado, pulmão e 18-20 em animais pequenos e grandes.
Nós também se adaptaram a mesma metodologia para produzir um pequeno andaime descelulada intestinal 21. O objectivo do método aqui descrito é para produzir matrizes intestinais descelularizados que mantêm as características macroscópicas do tecido original, tais como o fornecimento de sangue, bem como a arquitectura microscópica do eixo vilo-cripta no lúmen intestinal. Acreditamos que essa metodologia poderia finalmente ser adotado para outros órgãos para melhorar a eficiência de descelularização.
As etapas mais difíceis na criação deste experimento envolve a punção da SMA e do estabelecimento e manutenção de esterilidade. Canulação da SMA em roedores sem romper a parede pode ser bastante difícil devido ao tamanho ea posição do navio. Alternativamente, um fio de sutura pode ser colocada ao redor da aorta proximal antes da origem SMA, seguido por canulação da própria aorta distais, dirigindo a cânula de plástico para a SMA. Durante decellularization uma combinação de colocação de cânula pobres e altas taxas de fluxo pode resultar na perda do acesso vascular. A esterilidade é um problema importante, devido à quantidade da flora bacteriana do intestino delgado. A lavagem com PBS / AA a seguir à colheita é muito importante, e qualquer sinal de matéria fecal ou restos deve ser removido a partir do lúmen. Colocar uma porção do andaime num tubo Falcon com DMEM na incubadora após a esterilização de UV deverá ser um indicador se esterilidade foi alcançado. No casode colonização bacteriana, a mídia vai mudar o pH com a sua cor passando de vermelho para amarelo. Para lidar com isto, ciclos adicionais de UV são aconselhados, bem como a lavagem com PBS, contendo uma elevada concentração de antibiótico / antimicótico.
Uma modificação possível obter um andaime com acesso tanto vascular venoso e seria canular a veia cava inferior (IVC), bem como a SMA. Decelularização dos lados venosos e vasculares deve ser tentada de forma intermitente para as três soluções. Decellularization contínua pode estourar os vasos capilares fazendo com que a pressão positiva em ambos os lados.
Ao longo dos anos, tem havido uma série de esforços no intestinal TE usando diferentes combinações de células-andaime in vitro e in vivo 6,9,12. A maioria dos trabalhos foi realizada utilizando tubulares não tecido 95% PGA-5% PLGA andaimes revestidos com colágeno tipo I 6,7,13,22. Após a sementeira com intestinalunidades epiteliais organóide (OU) e um período de implantação no omento de ratinhos, que formam cistos com músculo do lado de fora e do epitélio por dentro, que pode então ser tubulares. No entanto, a porosidade e a simplicidade na concepção destas estruturas não permite a geração de grandes pedaços de intestino artificial, em um ambiente in vitro, tais como a de um bio-reactor. Além disso, a falta de uma rede vascular inata, que pode ser conectado ao recipiente limita ainda mais o uso de este andaime para tradução clínica. Além dos experimentos com os andaimes PGA-PLGA, outros grupos têm usado de colágeno ou SIS andaimes, sendo que ambos não replicar a complexidade do trato intestinal. SIS em particular, é a única metodologia publicada anterior de engenharia de tecido intestinal e tem sido usado em mais de 150 ambientes médicos, demonstrando a capacidade de andaimes descelularizados para proporcionar estabilidade mecânica e promover o crescimento celular, enquanto chumboção de resposta imunogênica. No entanto, a falta de macro-e micro-arquitetura apropriada, levou a resultados ruins em sua "utilização para fins TE intestinais 9-11,23.
Os benefícios da metodologia de descelularização temos descritos incluem a preservação das características microscópicas, tais como a arquitectura cripta-vilosidade luminal que representam um ambiente adequado para o repovoamento do nicho de células estaminais intestinal. No aspecto macroscópico, a presença de uma rede vascular hierárquica irá permitir ligação ao recipiente, permitindo fornecimento de nutrientes e oxigénio para toda a camada de a-TE intestino 21. Além disso, a manutenção de componentes da matriz extracelular, como colágeno, elastina e glyocosaminoglycans tem um papel importante não só para as características mecânicas, mas também dirigir proliferação e diferenciação celular. Mais importante, a capacidade de a metodologia de descelularização de ser melhorados em grander tecidos, enquanto mantendo as mesmas características é uma característica importante para a tradução clínica da TE.
O desenvolvimento de uma matriz intestinal natural com uma rede vascular permite a criação de grandes segmentos do intestino artificial, que pode ser ligado ao hospedeiro.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem ao Instituto Wake Forest de Medicina Regenerativa por sua ajuda com o desenvolvimento deste protocolo. Reconhecemos o apoio por doações da caridade Great Ormond Street Hospital, a Fundação Eugenio Litta (Genebra, Suíça), o Conselho de Pesquisa Médica, o Colégio Real de Cirurgiões da Inglaterra, as faíscas Infantil Medical Caridade, o Ministério do Exterior britânico para o Reino Unido / EUA Stem Cell Collaboration Award e ao Fundo de Investigação Mittal. Gostaríamos também de agradecer à Fundação Royal Society / Wolfson para a engenharia de tecidos concessão remodelação laboratório obtidos para o Departamento de Cirurgia Pediátrica do Instituto de Saúde da Criança. PDC e SE são suportados por caridade o Great Ormond Street Hospital da Criança.
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
Sodium chloride | |||
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |