Artikkelen beskriver en metode for produksjon av en acellulær matriks fra rotte tarm. Avledning av tarm stillaser er viktig for fremtidige anvendelser innen tissue engineering, stamcellebiologi og narkotika testing.
Vellykket tissue teknikk involverer kombinasjonen av stillaser med egnede celler in vitro eller in vivo. Stillas kan være syntetisk, naturlig-avledet eller avledet fra vev / organer. Det sistnevnte blir oppnådd ved bruk av en teknikk som kalles decellularization. Decellularization kan innebære en kombinasjon av fysiske, kjemiske og enzymatiske metoder. Målet med denne teknikken er å fjerne alle mobiltelefon spor samtidig opprettholde den makro-og mikro-arkitektur av den opprinnelige vev.
Intestinal tissue engineering har så langt brukt relativt enkle stillaser som ikke gjenskape den komplekse arkitekturen av de innfødte organ. Fokuset i denne artikkelen er å beskrive en effektiv decellularization teknikk for rotte tynntarmen. Isoleringen av tynntarmen, for å sikre opprettholdelsen av en vaskulær forbindelsen er beskrevet. Den kombinasjon av kjemiske og enzymatiske løsninger for å fjerne cellene whilst bevare villus-krypten aksen i luminal aspektet av stillaset er også satt ut. Til slutt, er vurderingen av produsert stillaser for egnede egenskaper diskutert.
Tissue engineering (TE) gir et terapeutisk alternativ til organtransplantasjon, omgåelsen saker av immunsuppresjon og organmangel. TE har nylig hatt vellykkede søknader i klinikken, med utskifting av organer som blære 1, urinrør 2 og luftrør, både hos voksne 3,4 og barn 5.
Bygge en vev-konstruert organ nødvendig kombinasjonen av et stillas med de riktige cellene. Et stillas, kan fremstilles ved hjelp av naturlig-avledet (f.eks kollagen) og syntetiske (for eksempel poly-L-glykolsyre; PLGA) materialer, eller kan oppnås ved decellularization native organer og vev. Stillas som har vært brukt hittil for intestinal TE har hovedsakelig vært enten decellularized (small intestinal submucosa) eller syntetiske (poly-L-glykolsyre og poly-melkesyre) 6-13. Disse biomaterialer er svært enkle i både makro-og mikro-arkitektur, somkan ikke være ideelt hvis vev-konstruert tarmen er å være klinisk oversatt. En optimal biomateriale for tarmen bør ha en medfødt vaskulære treet som kan kobles til vertens blodtilførsel, et lagdelt rørveggen med ulike egenskaper for å reflektere de lag av tarmveggen og villus-krypt aksen på luminale side for å hjelpe til med repopulation av epitel stamceller.
Decellularization er en roman metodikk som produserer stillaser ved å fjerne celler fra hele organer samtidig opprettholde sin opprinnelige arkitektur 14. Dette er å foretrekke fremfor eksisterende stillaser, siden de ikke bare replikere strukturen av organet, men også inneholder kjemiske signaler integrert i den ekstracellulære matriks (ECM) som kan benyttes til cellulær proliferasjon og differensiering. I 2008 en avdød luftrøret ble decellularized 14, sådd med pasientens egne celler, og transplantert til å erstatte de viktigste venstre bronkie i en ung mann <sup> 3. Siden da har en rekke grupper rapportert produksjon av decellularized stillaser for hjertet 15, lever 16,17, og lunge 18-20 i små og store dyr.
Vi har også tilpasset den samme metode for å produsere et tynntarm decellularized stillaset 21.. Målet med fremgangsmåten beskrevet heri er å produsere decellularized tarm matriser som opprettholder de makroskopiske egenskaper av det opprinnelige vev slik som blodforsyning, så vel som den mikroskopiske arkitekturen på villus-krypten akse i tarmlumen. Vi tror denne metoden kan til slutt bli vedtatt for andre organer for å forbedre effektiviteten i decellularization.
De vanskeligste skritt i å sette opp dette eksperimentet involvere cannulation av SMA og etablering og vedlikehold av sterilitet. Kanylerør SMA hos gnagere uten sprekker i veggen kan være ganske vanskelig på grunn av størrelsen og posisjonen til fartøyet. Alternativt kan en sutur skal plasseres rundt den proksimale aorta før SMA opprinnelse, etterfulgt av kanylering av aorta seg distalt, dirigere plast kanyle inn i SMA. Under decellularization en kombinasjon av dårlig kanyle plassering og høye strømningshastigheter kan føre til tap av vaskulær tilgang. Sterilitet er et stort problem på grunn av mengden av bakterieflora som er tilstede i tynntarmen. Vask med PBS / AA etter innhøsting er svært viktig, og må fjernes noen tegn til avføring eller rusk fra lumen. Ved å legge en del av stillaset på en falkonrør med DMEM i inkubatoren følgende UV-steriliseringen skal være en indikator om sterilitet er oppnådd. I tilfelletav bakteriell kolonisering, vil mediet endrer pH med sin farge dreie fra rød til gul. For å håndtere dette på, er ytterligere UV-sykluser rådet samt vasking med PBS inneholdende en høy konsentrasjon av antibiotisk / antimykotisk.
En mulig modifikasjon å skaffe et stillas med både vaskulære og venetilgang vil være å cannulate inferior vena cava (IVC), så vel som den SMA. Decellularization fra venøse og vaskulære sider bør forsøkes i perioder for alle tre løsningene. Kontinuerlig decellularization kan sprenge blodkar ved å ha et positivt press på begge sider.
Gjennom årene har det vært en rekke tiltak i tarm TE ved hjelp av ulike celle-stillas kombinasjoner in vitro og in vivo 6,9,12. Hoveddelen av arbeidet er utført ved hjelp av rørformede vevde 95% PGA-5% PLGA stillasene belagt med kollagen type I 6,7,13,22. Etter seeding med tarmepiteliale organoid enheter (OUS) og en periode av implantering i omentet hos mus, danner de cyster med muskel på utsiden og epitelet på innsiden som deretter kan tubularized. Imidlertid porøsiteten og enkelhet i utformingen av disse stillaser ikke tillater for generering av store stykker av kunstig tarmen i en in vitro miljø som den om en bioreaktor. I tillegg begrenser mangelen på en medfødt vaskulære nettverk som kan kobles til mottakeren videre bruken av dette stillas for klinisk oversettelse. Foruten de eksperimenter med PGA-PLGA stillasene, har andre grupper brukte kollagen eller SIS stillasene, som begge ikke gjenskape det detaljtarmkanalen. SIS spesielt er den eneste tidligere publiserte metode av tarmvevet teknikk og har vært benyttet i mer enn 150 medisinske innstillinger, som viser evnen til decellularized stillaser for å gi mekanisk stabilitet og fremme cellevekst, mens blying til ingen immunogene respons. Men mangelen på egnede makro-og mikro-arkitektur, har ført til dårlige resultater i sin 'bruk for tarm TE formål 9-11,23.
Fordelene med decellularization metodikk vi har beskrevet inkludere bevaring av mikroskopiske egenskaper som luminal krypten-villus arkitektur som representerer et passende miljø for repopulation av tarmstamcelle nisje. I den makroskopiske aspekt, vil tilstedeværelsen av en hierarkisk vaskulære nettverk muliggjøre befestigelse til mottakeren, slik at bestemmelsen av næringsstoffer og oksygen til alle lag av TE-tarmen 21. Hva mer er, har opprettholdelse av ECM-komponenter slik som kollagen, elastin og glyocosaminoglycans en viktig rolle, ikke bare for mekaniske egenskaper, men også å dirigere cellulær proliferasjon og differensiering. Det viktigste er muligheten av decellularization metodikk for å bli skalert opp til storr vev samtidig opprettholde de samme egenskapene er en viktig funksjon for klinisk oversettelse av TE.
Utviklingen av en naturlig tarm matrise med et vaskulære nettverket tillater etablering av større deler av kunstig tarm som kan kobles til verten.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Wake Forest Institute of regenerativ medisin for deres hjelp med utvikling av denne protokollen. Vi erkjenner støtte med tilskudd fra Great Ormond Street Hospital veldedighet, Stiftelsen Eugenio Litta (Genève, Sveits), Medical Research Council, Royal College of Surgeons of England, The Sparks Barnas Medical Charity, den britiske utenriksdepartementet for Storbritannia / USA Stem Cell Collaboration Award og Mittal forskningsfond. Vi vil også gjerne takke Royal Society / Wolfson Foundation for tissue engineering laboratorium oppussing stipend innhentet for Pediatric Surgery avdeling i Institute of Child Health. PDC og SE støttes av Great Ormond Street Hospital Children Charity.
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
Sodium chloride | |||
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |