Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em> In Situ</em> Hybridisierung in<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Abbildungen 1 und 2 sind schematische Darstellungen der FISH experimentellen Verfahren und Bildanalyse zur Quantifizierung Pipeline FISH Bildern verwendet. 1. Lösungen bereiten * Die folgenden Lösungen sind für den Einsatz mit Singer-Sonden. Bei Verwendung von Stellaris Sonden ersetzen "40% Formamid" mit "10% Formamid" sowohl Hybridisierung und Waschpuffer. Zusätzliche Änderungen an Hybridisierungspuffer bei Verwendung Stellaris Sonden sind (1) 1 g Dextransulfat und (2) nicht enthalten 10 mg ssDNA. Puffer B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1M K 2 HPO 4 109,3 g Sorbit Spheroplasting Buffer 890 ul Puffer B 100 ul VRC 10 ul 25.000 U / ml Lyticase 2 ul β-Mercaptoethanol <strong> Hybridisierungspuffer (10 ml, Endvolumen) 10 mg E. coli tRNA 10 mg ssDNA * 100 ul 200 mM VRC Lager 40 ul von 50 mg / ml BSA 1 ml 20X SSC 4 ml 40% Formamid * Nuclease Free Water (bis 10 ml Endvolumen) 1 g Dextransulfat * * Hybridisierungspuffer kann in 0,5 ml Aliquots bei -20 ° C werden der Einfachheit halber beibehalten. Waschpuffer (50 ml, Endvolumen) 5 ml 20X SSC 20 ml 40% Formamid * Nuclease Free Water (bis 50 ml Endvolumen) Markierungspuffer 1,06 g Sodium Carbonate 100 ml DEPC Wasser pH 9 2. Probe-Kennzeichnung (Singer Probes Only) Wir erhalten diese Sonden durch in-house-Synthese unter Verwendung eines ABI Oligonucleotidsynthese Gerät. TypicAlly werden 4-5 ~ 50 bp Oligonukleotide synthetisiert, die homolog zu dem Gen von Interesse, substituierende Aminosäure-allyl Thymidin mehrere Thymidinen Abstand von mindestens 8, vorzugsweise 10 + bp auseinander. Aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegenüber Ozon, arbeiten wir in einer Ozon-Anlage kostenlos bei der Verwendung von CY Farbstoffe. Erhalten ~ 5 Sonden und resuspendieren in 100 ul Wasser – check Konzentrationen auf Nanodrop. Je nachdem, wie viele Sonden / Gen verbinden insgesamt 10 ug Oligonukleotide / Gen (zB wenn haben 5 Sonden / Gen wollen, dann 2 ug / Sonde). Verwenden QIAquick Spalten Sonden nach QIAquick Nucleotide Removal Kit Protocol reinigen. In 10 Bänden Buffer PN, um die Lautstärke des kombinierten Sonden und Mix insgesamt. Bewerben Probe QIAquick Säule – wenn Gesamtvolumen größer als 750 ul, Spin-down zweimal mit der Hälfte des Volumens in jedem Spin Lassen Sie stehen für 1 min. Zentrifuge 1 min bei 6.000 Umdrehungen pro Minute. Waschen mit 750 ul Puffer PE. Zentrifuge1 min bei 6.000 Umdrehungen pro Minute. Entsorgen Durchströmung und Re-Spin-Säule für 1 min bei 13.000 rpm zu trocknen. Platz QIAquick Säule in neue Mikrozentrifugenröhrchens und eluieren DNA mit 50 ul H 2 O – Stellen Sie sicher, H 2 O pH innerhalb 7,0 und 8,5 und liegt direkt am Membran platziert. Lassen Sie stehen für 1 min. Säule für 1 min bei 13.000 rpm, um DNA zu eluieren. Lyophilisiert DNA bei 45 ° C Pellet in 10 ul Markierungspuffer und Rohr von Farbstoff hinzuzufügen, ohne den Farbstoff. Wiederholen Sie mit einem anderen 10 ul Markierungspuffer. Vortex und Spin-Down Tube Farbstoff und DNA. Röhrchen abdecken mit Alufolie aus und halten in Dunkeln bei RT O / N zu bezeichnen. Wiederholen QIAquick Nucleotide Removal Kit Protocol. Führen Sie mit zwei Unterschieden: – In 200 ul Puffer PN, Sonden und legte markierten Sonden durch Spalten 2x. – Führen Sie 3 Wäschen mit Puffer PE, um abzuwaschen ungebunden Farbstoff vor der Elution. After Elution erhalten Konzentration über nanodrop. Die Kennzeichnung Effizienz ist in der Regel ~ 0,25 pmol / ng einzelner DNA. 3. Coverslip Vorbereitung Platz Deckgläser auf Objektträger in Plasma-putzen Vakuumkammer ( http://www.plasmapreen.com/ ) (die näher am Zentrum, desto besser). Setzen Vakuumkammer in Mikrowelle und sicherstellen, dass es verschlossen ist. Schalten Sie Pumpe zuerst, dann auf Vakuum nur einmal drehen Pumpe gestartet wird. Schalten Sie Mikrowelle und stoppen 5 sec nach Plasma sichtbar ist. Schalten Sie dann Vakuum pumpen. Ziehen Sie Vakuumkammer und entfernen Deckgläser mit einer Pinzette (diejenigen, die gefallen muss wieder gereinigt werden). Platz Deckgläser gereinigt Seite nach oben in 12-Well-Platten. 4. Fixation Vorgehensweise Wachsen Hefe bis zu einer OD 600 von ca. 0,1-0,2 in minimal Medien. 10 ml von Zellen liefert genug for ~ 10 separate Hybridisierungen. 1/10 Volumen 37% Formaldehyd direkt an den Wachstums-Medien (10 ml Kultur + 1 ml 37% Formaldehyd) und lassen Sie sich für 45 min. Waschen Sie 2x mit 1 ml eiskaltem Puffer B in einem Mikrozentrifugenröhrchen (kann bei 13.000 rpm für 1 min drehen). 1 ml Spheroplasting Puffer. Bei 37 ° C für 15 min. Prüfen Zellen alle paar Minuten unter dem Mikroskop, bis die meisten Zellen schwarz (dh nicht-Phase hell) sind. 2x Waschen mit eiskaltem Puffer B, Schleudern bei niedriger Geschwindigkeit (~ 3.500 rpm). 1 ml 70% EtOH, resuspendieren vorsichtig und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C (unbegrenzt bei -20 ° C). 5. Hybridisierung Vorgehensweise Bereiten Sie die Hybridisierungslösung: zu 100 ul Hybridisierungspuffer, in der Regel 1-3 ul Sonde, dann Wirbel und Zentrifuge. Singer Sonden verwenden 8-10 ng Gesamt pro Sonde Set (dh pro Gen). Wir haben bis zu 3 Gene gleichzeitig mit 3 ver abgebildetschiedenen markierten Sonde setzt. Achten Sie darauf, die Hybridisierung Lösung auf Raumtemperatur erwärmen, bevor Sie es öffnen. Für Stellaris Sonden, ist es empfehlenswert, 4 separate Hybridisierungsreaktionen durch Zugabe von 1 ul jedes von 1:10, 1.20, 1:50 und 1:100 Verdünnungen von Sonden arbeiten, um zu sehen, welche optimal ist gestartet. Arbeiten Verdünnungen von Stellaris Sonden in Hybridisierungspuffer vorbereitet. Zentrifuge (für alle folgenden Schritte, 3.500 rpm, 5 min) die fixierten Zellen (z. B. 200 ul) und saugen das Ethanol entfernt. Vorsichtig in 1 ml Waschpuffer, die den gleichen Prozentsatz Formamid als Hybridisierungspuffer enthält resuspendieren. Lassen Sie stehen für 2-5 min. Zentrifuge Probe und absaugen Waschpuffer, dann fügen Hybridisierungslösung. Im Dunkeln unter leichtem Schütteln, O / N bei 37 ° C Hinweis: Die folgende Prozedur ist für die Anwendung / Bildgebung von Zellen auf Deckgläsern. Für wVeraschen / Bildgebung von Zellen in 96-Well-Platten, einschließlich anderer reaktiver Sauerstoffspezies Fängerlösung siehe http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols. Am nächsten Tag, oder im Voraus, sauber (siehe Arbeitsgang) einsetzen und behandeln Deckgläschen mit 150 ul 0,01% Poly-L-Lysin für 5 min. Absaugen, trocknen lassen, 3x mit dH 2 O und trocknen lassen. In der Früh, 1 ml Waschpuffer auf die Probe, sanft resuspendieren, Zentrifuge und absaugen, dann in einem anderen 1 ml Waschpuffer und Inkubation bei 37 ° C für 30 min resuspendieren. Waschen mit 2X SSC + 0,1% Triton X-100 bei RT 15 min auf Schüttler. Nehmen Sie den Einbau Medium aus der Tiefkühltruhe, damit sie kommen bis RT vor der Montage. Waschen mit 1X SSC bei RT 15 min auf Schüttler. Verdünnen DAPI in PBS (0,1 ug / ml final) und Zellen in 150 ul. Platz Lösung auf gereinigt / Poly-lys-TREAten Deckgläschen in 12-Well-Platte, mindestens 30 min ungestört. Lösung entfernen (Sie können es auf einem Ersatz-Deckglas als Backup zu platzieren) und waschen mit 1 ml 1X PBS 3x. Platz 3 ul verlängern Goldmontageecken Medium auf einem Objektträger (Invitrogen P36934). Tun Sie dies ein zu einer Zeit, wenn Sie mehrere Deckgläser zu vermeiden Trocknen des Eindeckmediums haben. In ~ 0,5 ml Ethanol in 12-Well-Platte Deckglas, entfernen Sie das Deckglas und der Luft trocknen lassen, während mit einer Pinzette. Zeigen Deckglas Zell-Seite nach unten auf Eindeckmediums und lassen verhärten mehrere Stunden oder O / N in der Dunkelheit. Seal die Ränder mit Nagellack und fahren Bildgebung. 6. Imaging von Zellen mit Olympus IX-81 Inverses Mikroskop Übersicht Für die Bildaufnahme nutzen wir Slidebook (intelligent-imaging.com) Software und ein 100X, 1,45 NA, TIRFM Öl-Objektiv. Für die serielle GFP, DAPI, Cy3, Cy5 und Cy3.5 imaging: Chroma-Filter-Sets (siehe Reagenzien). Verwenden DAPI-Filterzu finden und zu konzentrieren Zellen. Setzen Sie diese als Bezugspunkt. Werfen Sie einen z-Stapel von Bildern rund um den Bezugspunkt, wo die Gesamtstrecke beträgt 5 uM mit 0,2 uM Größe (25 Flugzeuge). Wiederholen Sie dies für jeden Farbstoff Kanal (dh jede Sonde set). Export als 16-Bit-TIFF für die Bildanalyse. 7. Bildanalyse Übersicht (Singer Probes) Im Folgenden geben wir einen Überblick über Berechnungsmethoden verwenden wir zur Analyse FISH Bilder in MATLAB. Die relevanten MATLAB-Funktionen verwendet werden, auf der rechten eingeklammert. Die Algorithmen und Schwellenwerte sind derzeit für Daten aus Singer-Sonden abgestimmt. Mit Stellaris-Sonden erfordert einige Anpassungen, insbesondere auf die endgültige Filterung Schritt (7.8). Zellidentifikation 15 Separate Zellen aus dem Hintergrund mit einem globalen Schwellwert auf DAPI Bilder 16 [graythresh]. Identifizieren Kerne mit erweiterten Maxima-Funktion [imextendedmax]. Segment Zellen mit Kernen als Keime für eine Wasserscheide-Algorithmus [Wendepunkt]. Finden Sie wichtige Punkte in jeder Fluoreszenzkanal Führen tophat Transformation Hintergrund normalisieren und verbessern Signal-Rausch-Verhältnis [bwmorph]. Finden Maxima, die In-Fokus-Schicht (in der z-Ebene) für jeden Punkt zu identifizieren [imregionalmax]. Filtern Potenzial Flecken mit einem linearen Modell fit zu einem radialen Farbverlauf. Measure Spotintensität und Filter einzigen vs mehrere Sondensignale Fit ein 2D-Gauß-Profil an die Stelle in der zuvor identifizierten In-Fokus-Schicht und Schätzung Intensität 17. Filtern Sie Schwachstellen mit einer Schwelle (basierend auf Histogramm). Für Singer-Sonden das ist wichtig, aber es ist weniger für Stellaris Sonden. Graf Flecken in jeder Zelle.