Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em> C. elegans</em
Summary
Burada uzun süreli koku adaptasyon moleküler okuma tarif<em> Caenorhabditis elegans</em>. Protein Kinaz G, EGL-4, AWC denilen bir çift primer duyusal sinir hücresi içinde kararlı uyum yanıtı için gereklidir. Sitoplazmada gelen AWC çekirdeği uzun süreli koku maruz EGL-4 translocates sırasında.
Abstract
Sürekli stimülasyon sırasında çoğu duyusal nöronlar sinyal onların hassasiyetini azaltarak tepki adapte olacaktır. Adaptasyon yanıtı şekli dikkatini yardımcı olur ve aynı zamanda aşırı uyarılması hücreleri korur. C. koku devre içerisinde İntibak elegans ilk Colbert ve Bargmann 1,2 tarafından tanımlanmıştır. Burada, yazarlar Amphid Kanat hücreleri tip C (AWC) duyusal nöronlar tarafından algılanan uçucu kokuları uyum yeteneklerini mutantlar kusurlu yalıtmak için genetik bir ekran tasarımı için kullanılan koku adaptasyon paradigma, parametreleri tanımlanır. Zaman yabani-tip C. elegans hayvanlar da koku onların yanıt uyum 30 dakika için çekici bir AWC-algılanan koku 3 maruz kalır ve daha sonra ~ 1 saat boyunca bir kemotaksis davranış tahlilinde adapte koku göz ardı eder. Zaman yabani-tip C. elegans hayvanlar daha sonra ac adapte koku yok sayacaktır ~ 1 saat için cazip bir AWC-algılanan koku maruz~ 3 saat hemotaxis davranış testi. C. koku adaptasyon Bu iki faz elegans kısa vadeli olfaktör adaptasyon (30 dak koku maruz kaldıktan sonra tetiklenen), ve uzun vadeli olfaktör adaptasyon (60 dk koku maruziyet sonrası uyarılan) olarak tanımlanmıştır. Daha sonra L'Etoile ark. Çalışmak, 4 AWC nöronlarda kısa vadeli ve uzun vadeli olfaktör adaptasyon hem de gereklidir EGL-4 denilen bir protein kinaz G (PKG) ortaya çıkardı. EGL-4 protein uzun süreli koku uyum yanıtı ancak AWC 4 kısa vadeli olfaktör uyum yanıtı için vazgeçilebilir için gerekli olan bir nükleer lokalizasyon dizisi içerir. Yeşil floresan protein ile etiketleme EGL-4 olarak, bu uzun süreli koku pozlama sırasında AWC yılında EGL-4 lokalizasyonu görselleştirmek için mümkün oldu. Bu tamamen işlevsel kullanarak biz AWC 5 uzun süreli koku adaptasyon moleküler okuma geliştirmek mümkün olmuştur EGL-4 (GFP :: EGL-4) molekülü GFP etiketli. Bu m Kullanmaolfaktör adaptasyon olecular okuması biz AWC 6,7 olarak GFP kusurlu hücre içi lokalizasyonu desenleri :: EGL-4 sergilerler mutant hayvanlar tanımlamak için hem ileri ve geri genetik ekranlar gerçekleştirmek mümkün olmuştur. Burada tarif: GFP 1) İnşaat :: EGL-4 eksprese hayvanlar; 2) uzun süreli koku indüklenen nükleer translokasyon deneyleri için hayvan yetiştiriciliği için protokol ve uzun vadeli koku indüklenen 3) puanlama Nükleer translokasyon olay ve nükleer GFP :: EGL-4 devlet kurtarma (re-sensitizasyon).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir GFP etiketli EGL-4 molekülünün koku indüklenen nükleer girdisinin burada açıklanan C. olfaktör uyum sağlam bir moleküler okunmasını sağlar elegans. Koku indüklenen nükleer translokasyon testleri basittir ve hazırlık süresi sadece birkaç gün gerektirir. Bu deneyleri için yapılmış olduğu pyIs500 hayvan, AWC nöron hem de GFP-etiketli EGL-4 proteini ifade aydınlatan bir işaretleyici ifade eder. Böylece, nöron bu sınıf ile çalışan hiçbir deneyimi az olan bir …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu yazıda dikkatli okumak için Scott Hamilton ve O'Halloran laboratuar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Biz de mükemmel öneriler ve anlayışlı yorum için anonim yorumcusu ederim.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | DF0140-07-4 | NGM plates |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S671-10 | NGM plates |
| Bacto Peptone | Difco | DF0118-07-2 | NGM plates |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Kimwipes – Small | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| Ethanol 100% | Gold Shield Chemical Co. | 43196-115 | diluting odors for chemotaxis assays |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM plates |
| Magnesium Sulphate | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM plates |
| Sodium Azide 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | Anesthetic |
| Agarose – UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Agarose pads |
| Benzaldehyde | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC odor |
| Butanone, ACS Grade | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC odor |
| Microcentrifuge Tubes – 1.5 ml Colored | Denville | LS8147 | |
| Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4″ | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV integration |
| Filter Vacuum Bottle – 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
Referenzen
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803 (1995).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).
- Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515 (1993).
- L’Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
- Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107 (13), 6016 (2010).
- O’Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).
- O’Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).
- Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
- Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314 (1999).
- L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25 (3), 575 (2000).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetik. 77 (1), 71 (1974).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
- Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).
- Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).
