A قراءات الجزيئية من التكيف على المدى الطويل في الشم<em> C. ايليجانس</em
Summary
نحن هنا وصف قراءات الجزيئي للتكيف على المدى الطويل في حاسة الشم<em> Caenorhabditis ايليجانس</em>. على البروتين كيناز G، EGL-4، ضروري لاستجابات التكيف مستقرة في زوج الخلايا العصبية الحسية الأولية دعا AWC. خلال فترات طويلة من التعرض translocates رائحة-4 EGL من العصارة الخلوية لنواة AWC.
Abstract
خلال التحفيز المستمر والخلايا العصبية الحسية الأكثر استجابة التكيف عن طريق خفض حساسيتها للإشارة. استجابة التكيف يساعد اهتمام شكل ويحمي الخلايا من التحفيز أيضا بين أكثر. التكيف داخل الدائرة حاسة الشم من C. وكان أول وصف ايليجانس من كولبير وBargmann 1،2. هنا، والكتاب تعريف المعلمات لنموذج التكيف حاسة الشم، التي تستخدم لتصميم شاشة الوراثية لعزل طفرات معيبة في قدرتها على التكيف مع الروائح المتطايرة لمست من قبل الخلايا العصبية Amphid نوع الجناح الخلايا (AWC) C الحسية. عندما wildtype C. ويتعرض الحيوانات ايليجانس لرائحة جذابة لمست AWC-3 لل30 دقيقة وسوف التكيف مع استجابتها للرائحة وسيتم تجاهل ثم رائحة التكيف في الفحص الكيميائي لالسلوكية للساعة 1 ~. عندما wildtype C. ويتعرض الحيوانات ايليجانس لرائحة جذابة لمست-AWC للساعة 1 ~ أنها سوف تتجاهل ثم رائحة التكيف AC فيhemotaxis الفحص السلوكي للساعة 3 ~. هاتين المرحلتين من التكيف حاسة الشم في C. وقد وصفت ايليجانس على المدى القصير التكيف الشمي (يسببها التعرض بعد 30 دقيقة رائحة)، وعلى المدى الطويل التكيف الشمي (يسببها التعرض بعد 60 دقيقة رائحة). العمل في وقت لاحق من L'نجم وآخرون.، كشفت 4 أ G بروتين كيناز (PKG) دعا EGL-4 ما هو مطلوب لكلا التكيف حاسة الشم قصيرة الأجل وطويلة الأجل في الخلايا العصبية AWC. و-4 EGL البروتين يحتوي على تسلسل توطين النووية ما هو ضروري على المدى الطويل ولكن استجابات التكيف حاسة الشم يمكن الاستغناء عنها على المدى القصير استجابات التكيف حاسة الشم في 4 AWC. من علامات EGL-4 مع البروتين الفلورية الخضراء، كان من الممكن تصور توطين EGL-4 في AWC خلال التعرض لفترات طويلة رائحة. استخدام هذا تعمل بكامل طاقتها GFP الموسومة EGL-4 (GFP :: EGL-4) جزيء كنا قادرين على تطوير قراءات الجزيئي للتكيف على المدى الطويل في حاسة الشم ال 5 AWC. استخدام هذا مقراءات olecular التكيف حاسة الشم كنا قادرة على أداء كل من الأمام وعكس شاشات الجينية لتحديد الحيوانات التي تظهر متحولة معيبة أنماط توطين التحت خلوية من GFP :: EGL-4 في 6،7 AWC. نحن هنا وصف: 1) بناء GFP :: EGL-4 معربا عن الحيوانات؛ 2) بروتوكول لزراعة الحيوانات لفترة طويلة الأجل المقايسات إزفاء رائحة بفعل النووية، و 3) التسجيل للمن صنع رائحة طويلة الأمد الحدث النووية إزفاء والانتعاش (إعادة التوعية) من GFP النووية :: EGL-4 الدولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
دخول رائحة النووية التي يسببها جزيء من GFP الموسومة-4 EGL الموصوفة هنا يقدم قراءات قوية الجزيئي للتكيف حاسة الشم في C. ايليجانس. رائحة الناجم عن المقايسات إزفاء النووية هي واضحة وتتطلب سوى بضعة أيام من وقت الإعداد. الحيوان pyIs500 أننا شيدت لهذه المقايسات، يعبر عن ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر سكوت هاملتون، وأعضاء المختبر O'Halloran لقراءة متأنية لهذه المخطوطة. نشكر أيضا مجتمعنا مجهول للحصول على اقتراحات ممتازة والتعليقات الثاقبة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | DF0140-07-4 | NGM plates |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S671-10 | NGM plates |
| Bacto Peptone | Difco | DF0118-07-2 | NGM plates |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Kimwipes – Small | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| Ethanol 100% | Gold Shield Chemical Co. | 43196-115 | diluting odors for chemotaxis assays |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM plates |
| Magnesium Sulphate | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM plates |
| Sodium Azide 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | Anesthetic |
| Agarose – UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Agarose pads |
| Benzaldehyde | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC odor |
| Butanone, ACS Grade | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC odor |
| Microcentrifuge Tubes – 1.5 ml Colored | Denville | LS8147 | |
| Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4″ | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV integration |
| Filter Vacuum Bottle – 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
Referenzen
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803 (1995).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).
- Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515 (1993).
- L’Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
- Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107 (13), 6016 (2010).
- O’Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).
- O’Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).
- Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
- Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314 (1999).
- L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25 (3), 575 (2000).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetik. 77 (1), 71 (1974).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
- Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).
- Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).
