شامل التنميط من لائحة الدوبامين في المادة السوداء والمنطقة الجوفية السقيفية
Summary
وينظم بوضوح الدوبامين في نواة الدماغ المتوسط، والتي تحتوي على خلية وهيئات والتشعبات من الخلايا العصبية المنتجة للدوبامين. نحن هنا وصفا لنهج ونموذج تشريح مناولة إلى تحقيق أقصى قدر من النتائج، وبالتالي استنتاجات ورؤى، بشأن تنظيم الدوبامين في الدماغ المتوسط نواة من المادة السوداء (SN) ومنطقة الجوفية السقيفية (VTA) لدى القوارض.
Abstract
الدوبامين هو ناقل عصبي درس بقوة في الجهاز العصبي المركزي. في الواقع، قد عزز مشاركتها في النشاط الحركي والسلوك المتصل بالإثابة، خمسة عقود من التحقيق في أوجه القصور الجزيئية المرتبطة مع تنظيم الدوبامين. غالبية هذه التحقيقات من تنظيم الدوبامين في الدماغ التركيز على الأساس الجزيئي لائحته في مناطق ميدان المحطة من المسارات السوداوي وmesoaccumbens؛ المخطط والمتكئة نواة. وعلاوة على ذلك، وركزت هذه الدراسات على تحليل محتوى الأنسجة الدوبامين مع التطبيع فقط لوزن النسيج الرطب. التحقيق من البروتينات التي تنظم الدوبامين، مثل هيدروكسيلاز التيروزين (TH) بروتين، الفسفرة TH، نقل الدوبامين (DAT)، ونقل مونوامين حويصلي 2 (VMAT2) بروتين في كثير من الأحيان لا تشمل تحليل محتوى الأنسجة الدوبامين في نفس العينة. القدرة على تحليل محتوى كل من الأنسجة الدوبامين والبروتينات التي تنظم فيها (بما في ذلك في مرحلة ما بعد هيئة تنظيم الاتصالاتتعديلات nslational) لا يعطي سوى القوة الكامنة في تفسير العلاقة بين دوبامين مع مستوى البروتين وظيفة TH، DAT، أو VMAT2، بل يمتد أيضا اقتصاد عينة. وهذا يترجم إلى أقل التكاليف، وحتى الآن تنتج نظرة ثاقبة لتنظيم الجزيئي للدوبامين في نموذج تقريبا أي خيار من المحققين.
ونحن نركز على التحليلات في المخ الأوسط. على الرغم من أن تهمل عادة SN وVTA في معظم الدراسات من تنظيم الدوبامين، وتشريح هذه النوى بسهولة مع الممارسة. ويمكن إجراء قراءات شاملة لمحتوى الأنسجة الدوبامين وTH، DAT، أو VMAT2. هناك ازدهار الأدب عن تأثير وظيفة الدوبامين في التعطيل وVTA على السلوك، والإصطدامات من المواد الخارجية أو عمليات المرض فيها 1-5. وعلاوة على ذلك، ومركبات مثل عوامل النمو يكون لها تأثير عميق على البروتينات الدوبامين والدوبامين التنظيم، إلى حد أكبر نسبيا في التعطيل أو VTA <sup> 6-8. لذلك، يتم تقديم هذه المنهجية لتكون مرجعا للمختبرات التي ترغب في توسيع نطاق تحقيقاتها حول كيفية علاجات محددة تعدل السلوك وتنظيم الدوبامين. هنا، ويقدم وسيلة متعددة الخطوات لتحليل محتوى الأنسجة الدوبامين، ومستويات بروتين من TH، DAT، أو VMAT2، والفسفرة TH من المادة السوداء وVTA من المخ الأوسط القوارض. ويمكن تحليل الفسفرة TH تسفر عن رؤى كبيرة ليس فقط في كيفية تنظيم نشاط عشر، ولكن أيضا في أجهزة الطرد المركزي مما يشير المتضررين في نوى somatodendritic في نموذج معين.
وسوف نوضح تقنية تشريح للفصل بين هذه النوى اثنين وتجهيز عينة من الأنسجة التي تنتج تشريح لمحة كشف الآليات الجزيئية لتنظيم الدوبامين في الجسم الحي، محددة لكل نواة (الشكل 1).
Protocol
Discussion
كما هو مبين في الشكل رقم 1، وينبغي أن الأساليب المفصلة أعلاه تعطي قراءات متعددة من الدوبامين وTH لها البروتينات التي تنظم، DAT، وVMAT2 من عينة واحدة من التعطيل أو VTA تم الحصول عليها من الفئران أو الماوس. مرة أخرى، وفوائد تنفيذ هذا البروتوكول، أن المحقق يمكن الحصول على قراء?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدمت التمويل اللازم لهذا العمل، واستشهد بها 2،10، في جزء منها عن طريق البحث الجوائز منحة لسالفاتوري MF من الاتحاد الأمريكي لبحوث الشيخوخة، وعين إدوارد السلالم الصندوق الاستئماني ومؤسسة البحوث الطبية الحيوية من ولاية لويزيانا الشمالية الغربية، وBS بروت من زمالة Muslow آيك Predoctoral، LSU مركز علوم الصحة، شريفيبورت.
Materials
HPLC system:
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.
The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.
Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | – J.T. Baker | 4095-02 |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG |
| Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG |
| Glycerol | Sigma | G8773-500 mL |
| PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG |
| dPBS | Gibco | 21600-069 |
| Tween20 | Sigma | P1379-500 mL |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG |
| Ponceau S | Fluka | 81460 |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G |
| Dithiothreitol | Sigma | D-9163 |
| Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo- Fisher Scientific | 23223 |
| Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 |
| [125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer |
Table 2. Specific reagents.
| Reagents | Formulas |
| 10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 |
| 1% SDS (pH to 8.2) |
|
| Copper II Sulfate Solution |
|
| 3X Sample Buffer |
|
| 1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 |
| 10X Running Buffer (Makes 4 L) |
|
| 10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) |
|
| Ponceau |
|
| .2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 |
| PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) |
|
| 10X Blot Buffer (Makes 4 L) |
|
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11.
Referenzen
- Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation. PLoS ONE. 4, e8466 (2009).
- Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. Dopamine controls persistence of long-term memory storage. Science. 325, 1017-1020 (2009).
- Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat. Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).
- Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal. J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).
- Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).
- Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra. J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).
- Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving. Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).
- Lavicky, J., Dunn, A. J. Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis. J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S. Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways. PLoS ONE. 7, e29867 (2012).
- Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds. J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).
- Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ. J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).
- Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis. J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).
- Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum. J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).
