Une description détaillée de la souris îlot isolement est décrit en utilisant la technique de la ponction du pancréas in situ canalaire et la perfusion d'une combinaison de collagénase purifiée et la protéase neutre.
L'interrogatoire de l'expression génique des cellules bêta et la fonction in vitro a carrément changé au fil des ans à partir de l'étude des lignées de rongeurs tumorigènes de cellules à l'étude des îlots isolés de rongeurs. Îlots primaires offrent l'avantage qu'elles reflètent plus fidèlement la biologie des voies de signalisation intracellulaires et les réponses sécrétoires. Considérant que la méthode d'isolement des îlots de tissu à l'aide d'enzymes dissociant (TDE) préparatifs a été bien établi dans de nombreux laboratoires de 1-4, les variations de la consistance du rendement et de la qualité de l'îlot n'importe quelle souche de rongeurs donnée limiter la portée et la faisabilité des études primaires îlots. Ces variations se produisent souvent à la suite des TDES brut partiellement purifiés utilisés dans la procédure d'isolement des îlots; TDES présentent souvent beaucoup à beaucoup variations de l'activité et nécessitent souvent des ajustements de la dose d'enzyme utilisée. Un petit nombre de rapports ont utilisé pour purifier TDES isolements cellulaires de rongeurs 5, 6 </sup>, mais la pratique n'est pas très répandue malgré l'utilisation de routine et les avantages de purifier TDES pour isolements d'îlots humains. En collaboration avec VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), nous avons développé un protocole de souris modifiée îlot isolement basé sur celui décrit par Gotoh 7, 8, dans lequel les TDES sont perfusés directement dans le canal pancréatique de souris, suivie d'un fractionnement du tissu brut par un gradient Histopaque 9, et l'isolement des îlots purifié. Une différence significative dans notre protocole est l'utilisation de la collagénase purifiée (CI enzyme MA) et neutre protéase (enzyme CI BP) combinaison. La collagénase a été caractérisé par l'utilisation d'un 6 collagène fluorescence activité (CDA) test dégradants qui ont utilisé marquées par fluorescence solubles fibrilles peau de veau comme substrat 6. Ce substrat est plus prédictif de la cinétique de dégradation du collagène dans la matrice de tissu, car il repose sur le collagène natif comme substrat. La protéase est CHaracterized avec un test sensible cinétique fluorescente 10. L'utilisation de ces tests améliorés ainsi que l'analyse biochimique plus traditionnelle activer le chiffrement transparent des données à fabriquer plus cohérente, conduisant à la cohérence entre les lots de meilleures performances. Le protocole décrit ici a été optimisé pour un rendement maximal et de la morphologie des îlots îlot optimale en utilisant C57BL / 6. Au cours de l'élaboration de ce protocole, plusieurs combinaisons de collagénase et de protéases neutres ont été évaluées à différentes concentrations, et le rapport final de la collagénase: protéase neutre de 35:10 représentent le rendement enzymatique comparable à Sigma Type XI. Parce que la variabilité importante des rendements des îlots moyenne de différentes souches de rats et de souris ont été signalés, des modifications supplémentaires de la composition TDE devraient être faits pour améliorer le rendement et la qualité des îlots de récupération à partir de différentes espèces et souches.
Dans ce protocole, nous avons décrit notre procédure de cathétérisme, perfusion de collagénase, et la dissociation du pancréas de souris, dans le but d'isoler les îlots de Langerhans. Techniquement, notre méthode, une fois maîtrisé, devrait permettre à l'isolement du pancréas moins de 4 min de l'euthanasie de l'animal, et en 1 heure devrait aboutir à l'isolement d'îlots à partir d'un seul animal. La rapidité de la technique nous permet d'isoler les îlots de jusqu'à 12 souris à un étirement typique, ce qui conduit à l'isolement de jusqu'à 3.000 îlots.
Contrairement à d'autres protocoles qui utilisent des préparations brutes de collagénase, notre protocole comprend l'utilisation de protéases purifiées, CI enzyme collagénase et MA CI enzyme protéase BP. Les variations de la consistance des préparations TDE qui sont disponibles dans le commerce exige que chaque lot soit individuellement testées et optimisées avant l'utilisation générale. Cette variabilité de lot à lot nous a conduit à envisager l'utilisation de puriTDES fiés de VitaCyte. Ces TDES hautement purifiés sont caractérisés par plusieurs méthodes, y compris l'utilisation de tests de fluorescence sensibles substrat marqué. Le dosage de fluorescence CDA est plus sensible aux différentes formes moléculaires de la collagénase qui ont des cinétiques différentes de collagène natif dégradants. Historique des dosages de substrats peptidiques fournir une évaluation incomplète de la collagénase. Caractérisation de la collagénase par des méthodes multiples assure une plus grande activité enzymatique entre les lots.
Sur la base de notre propre test en utilisant une variété de préparations de collagenase disponibles dans le commerce, nous avons constaté que les combinaisons d'enzymes purifiées donné reproductibles de lot à lot résultats. Les principaux avantages de l'utilisation de TDES hautement purifiés et rigoureusement caractérisée dans la présente demande sont une fois de la composition enzymatique optimale est définie, la cohérence de ses performances de lot à lot est assurée. Cette cohérence élimine le processus laborieux de qualification beaucoup normalement requispour les produits bruts de la collagénase ou enrichi. TDES purifiées également permettre des modifications supplémentaires de la composition afin d'améliorer le rendement et la qualité des îlots récupérés à partir de différentes souches de souris. Rapports compositions enzymatiques optimales pour l'isolement des îlots de différentes souches de souris peuvent être plus efficacement communiquées. Ceci, à son tour, conduit à une utilisation plus productive des ressources et une meilleure flexibilité dans la conception expérimentale.
Il ya beaucoup d'étapes essentielles qui peuvent affecter le résultat de l'isolement des îlots en utilisant notre protocole. Le premier est la nécessité de parvenir à l'inflation effective du pancréas au cours de la perfusion de la préparation enzymatique. Il est important de commencer l'inflation avec une force douce de la seringue, et augmenter la force que les gonfle pancréas. Il est utile de déplacer les intestins et le pancréas soulever lors du gonflage de sorte que la collagénase perfuse l'organe entier. Une autre étape importante est la force avec laquelle on secoue l'AFTE tubesr incubation à 37 ° C (étape 2,2). Nous avons constaté que le pancréas secouant durement contre le bouchon du tube provoque la fragmentation des îlots, mais sans aucune forme de dissociation mécanique à cette étape, les rendements des îlots peut chuter dramatiquement. Il est également impératif que lors de l'étape de dissociation avec la seringue (étape 2.5), une force de niveau moyen est appliqué pendant le mouvement de haut en bas avec le piston, ce qui assure la dissociation tissulaire adéquate avant l'étape de filtrage (2,6), où très peu de tissu doit être retenu sur le filtre passoire à thé. Enfin, la dernière étape à suivre attentivement l'aspiration de l'ensemble de 20 ml de HISTOPAQUE les îlots fractionnés. Bien que les îlots sont généralement à l'interface de la histopaque et HBSS, nous avons constaté que nous perdons îlots quand nous essayons de supprimer uniquement l'interface, au contraire, nous avons maintenant retirer la totalité des 20 ml à l'aide d'une pipette de grand alésage 25 ml. Nous avons ajouté la filtration à travers le filtre 70 um inversé (étape 2.11) afin d'éliminer la nécessité de centrifuge les îlots à plusieurs reprises pour laver la histopaque.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (à la fois pour RGM).
Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
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Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |