Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease

A. Benötigte Materialien: Siehe Tabelle 1 (Reagenzien) vor der Zubereitung HBSS (P / S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 + 1% Penicillin / Streptomycin (im Kühlschrank gelagert oder auf Eis gelagert). 20% BSA Lager wird in Wasser hergestellt und aliquotiert und bei -20 ° C. HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml 20% BSA (BSA endgültige Konzentrationen von 0,3%) Islet-Medium: RPMI + 10% FBS + 1% Glutamin + 1% Penicillin / Streptomycin Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque 1077 + 200 ml Histopaque 4-0 Suture (McKesson): in 2 ¾ Zoll-Stücke geschnitten und in einer 10 cm Petrischale Instrumente: Beugen Sie die Zange von Fine Science Tools, um 90 °, und feilen Sie den gezackten Zähnen aller drei Paare der Zange. Das Ziel ist es langweilig die Zähne, nicht um sie zu entfernen. Kanüle zur Verabreichung von Kollagenase / Protease Mischung: 27G ½ in. Nadel, 30 ½ in.Nadel, PE50 Schlauch in 12 in. Stücke schneiden. Datei beider Nadeln auf eine glatte abgerundete Ende die keine scharfen Kanten aufweist. Legen des 27G Nadel in ein Ende eines 12 Zoll Stück PE50-Schlauch. Entfernen Sie die 30G Nadel aus dem Gehäuse durch die Zerschlagung der Gehäuse mit einer Zange, Drehen des Gehäuses ¼ Drehung jeder Zeit. Entfernen Sie die Nadel mit der Zange aus dem Gehäuse und legen Sie sie in das andere Ende des PE50 Rohre unter einem Dissektionsmikroskop. Achten Sie darauf, nicht knicken Sie den Schlauch, wie Sie die Nadel legen in den PE50 Rohre. Die 27G Nadel ist das Ende, dass Sie die Spritze von Kollagenase befestigen. Collagenase (CI zyme MA) und Neutral Protease (CI zyme BP). Lösen Sie das TDE den Anweisungen des Herstellers. Finden Sie auf der chargenspezifischen Zertifikat für Analyse, um die Enzymaktivität Konzentration zu berechnen. Übertragen insgesamt 350.000 Kollagen abbauenden Aktivität (CDA) Einheiten der rekonstituierten Kollagenase und 100.000 neutrale Protease Einheiten der reconstitausgeschüttet BP Protease in eine konische Röhre und verdünnter bis 15 ml Gesamtvolumen in HBSS (P / S) B. Step-by-Step-Protokoll Ein. Inflation der Bauchspeicheldrüse mit Collagenase / Protease Mischung Euthanize Maus durch zervikale Dislokation, sättigen die Maus Torso mit 70% EtOH, offene Bauchhöhle vollständig vom Anus bis Membran mit irgendwelchen Dissektion Schere und Pinzette. Platzieren Sie die Maus auf der Plattform eines Dissektionsmikroskop. Ziehen Sie das Caecum und Colon ascendens aus und setzen Sie sie außerhalb der Körperhöhle zu Ihrer Linken. Siehe Abbildung 1 für eine Zusammenfassung der folgenden Schritte aus. Positionieren der Lappen der Leber gegen das Diaphragma, sie sollten dort verbleiben, wenn die Körperhöhle offen ist weit genug. Finden Sie die Leberarterie, Pfortader und Gallengänge Bündel führt in der Leber durch Ergreifen des Duodenums mit gebogenen Pinzette. Mit einem anderen Paar von gekrümmten Pinzette unter der Arterie, Vene zu erreichen, und Kanal bundle und ziehen ein 2 ¾ in. Stück 4-0 Naht unter der Arterie, Vene, Gallengang und binden Sie es einmal und ziehen Sie es fest, wie die Leber wie möglich zu schließen. Mit zwei Paaren gekrümmter Pinzette vorsichtig greifen den Zwölffingerdarm und finden den Gallengang an den Zwölffingerdarm an der Papille. Verwenden Sie eine Zange der Zange durch die Bauchspeicheldrüse und Bindegewebe direkt unter dem Gallengang in der Nähe der Papille stecken. Stecken Sie Ihre Pinzette schnell durch das Organ, um ein Loch zu machen und dann legte beide Zangen Zangen durch und greifen noch 2 ¾-Zoll-Stück von 4-0 Faden durch und binden Sie es einmal und ziehen Sie es auf einen kleinen Kreis, aber NICHT festziehen. Wechseln Sie in den 90 °-Zange und den Superfine Vannas Schere. Mit den 90 ° Pinzette vorsichtig kneifen und ziehen Sie den Dünndarm bis zum Gallengang ist straff. Machen einer horizontalen Schnitt über die Papille mit der Schere von stechenden die offenen Schere in den Darm und dann das Schneiden mit einer Bewegung. Versuchen Sie, nur one geschnitten über die Papille ohne Lösen des Gallengang aus der Papille. Halten Sie den Darm mit den 90 °-Zange, die Kanüle in den Gallengang bis zur Hälfte der Länge der Gallengang, und dann ziehen Sie den Faden fest um die Kanüle. Füllen Sie ein 3-ml-Spritze mit 2,0 ml Collagenase / Proteasegemisch und injizieren in die Kanüle in einem langsamen, konstanten Tempo. Nach dem Aufblasen der Bauchspeicheldrüse abgeschlossen ist, entfernen Kanüle aus Gallengang und verwenden Sie die gebogenen Pinzette und gekrümmte Feder Schere, um die aufgeblasenen Bauchspeicheldrüse ab dem absteigenden Dickdarm und Schnippeln des Bindegewebes, wie Sie den Darm ziehen zu entfernen. Weiterhin die Bauchspeicheldrüse aus dem Darm zu entfernen, bis Sie den Gallengang zu erreichen, entfernen Sie dann die Bauchspeicheldrüse aus der Milz, dann den Magen und dann aus dem Eingeweide der Bauchhöhle. Fertig Entfernen von Schnippeln entfernt die Nähte. Fügen Sie die Bauchspeicheldrüse zu einer 50-ml-Tube mit 5 ml HBSS(P / S). Dieses Rohr sollte auf Eis sein. Wiederholen Sie den oben beschriebenen Vorgang für jedes Tier bis zu vier Tiere. Für optimale Ergebnisse distanzieren nur vier Pankreata auf einmal. Typischerweise, während die ersten vier in der 37 ° C warmen Wasserbad sind, blasen wir vier weitere Pankreata. 2. Pancreas Dissoziation Platzieren Sie die 50 ml Röhrchen mit dem Pankreas in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Schütteln Sie den Schlauch und überprüfen Gewebedissoziation, lesen Gewebe kommt leicht auseinander, dann wirbeln die Rohre 12 Mal, während Sie halten den Schlauch durch den Deckel. Fügen Sie nicht mehr als 30 ml HBSS (BSA) (dies kann eine geringere Menge, je nachdem, wie viel benötigt wird, um die Rohre für den Zentrifugationsschritt auszugleichen) und Zentrifuge bei 290 xg für eine min. Anzusaugen Überstand vorsichtig und lassen eine kleine Menge des Überstandes (2-3 ml) am Boden, um so nicht stören die Zellpellet. Mit einem 30-ml-Spritze attached bis 14G Nadel, fügen Sie nicht mehr als 10 ml HBSS (BSA) und saugen die Aussetzung nach oben und unten 2 mal. Filtern das Zellgemisch durch ein Kunststoffrohr Teesieb in ein 50 ml Röhrchen und spülen mit weiteren 10 ml HBSS (BSA). Zentrifuge bei 330 xg für 2 min. Dekantieren und invertieren Rohre auf einem saugfähigen Papiertuch für 1 min abtropfen lassen. Resuspendieren jedes Rohr in 10 ml kaltem 1100 HISTOPAQUE. Überlagern die HISTOPAQUE mit 10 ml HBSS (BSA) und zentrifugieren bei 900 xg für 18 min. Entfernen Sie die gesamten 20 ml Überstand mit einer großen Bohrung 25 ml Pipette und die überstehende durch eine invertierte 70 um-Filter. Spülen Sie die Inseln in eine 10 cm Petrischale durch Pipettieren 10 ml Insel media durch den Filter, während es rechts oben über der Schüssel. Kultur der Inseln in einem 37 ° C, 5% CO 2 Gewebekultur-Inkubator bis bereit für Experimente. Typischerweise werden Inselchen handverlesen und zählte vor experimentation. 3. Repräsentative Ergebnisse Islet Erträge, Morphologie und Qualität sind die allgemeinen Parameter verwendet werden, um den Erfolg der Inselisolierung beurteilen. In unseren Händen sind islet Erträge aus dem durchschnittlichen C57BL / 6 Maus im Bereich von 150-250 Inselchen dieses Protokoll verwenden (siehe Tabelle 2), und sind vergleichbar mit erhaltenen Daten mit optimierten Sigma XI Kollagenase. Allerdings können Ausbeuten variieren in Abhängigkeit von dem Mausstamm verwendet und dem Alter der Maus. Die meisten der Tiere, die wir verwenden, sind in der 8-16 Wochen Altersgruppe Dieses Protokoll auf mehreren Mausstämmen wurde getestet, darunter C57BL / 6 (180-250 Inseln / Maus), CD1 (200-300 Inseln / Maus), 129 / B6 (200-300 Inseln / Maus), BLKS-db/db (120-200 Inseln / Maus), NOD (10 Wochen alt, 100-150 Inseln / Maus) und NOD-SCID (100-150 Inseln / Maus ). Typische islet Morphologie ist in Abbildung 2 dargestellt, bei der Inselchen eine runde Gestalt mit relativ einheitlicher Größe länglich haben (obgleich Größe unif.ormity kann von Stamm zu variieren) belasten. Abbildung 3 zeigt unsere typische Analyse von Glukose-stimulierte Insulinsekretion aus C57BL / 6 Maus Inseln isoliert unter Verwendung von gereinigten TDES vs Sigma XI Kollagenase. Typischerweise wird ein hoher Qualität islet Zubereitung führt zu einer Insulinstimulation bei 25 mM Glukose, 6-20 mal größer als die mit 2,5 mM Glucose beobachtet wird. Andere Anwendungen können auch verwendet werden, um die Qualität von isolierten Inseln zu testen, und diese schließen Verwendung perifusion Techniken, Ca 2 +-Imaging (mit Fura2) und Reverse-Transkriptase-PCR, unter anderem 11. Abbildung 1. Eine Zusammenfassung der Kanülierung der Gallengang. Abbildung 2. Typische Erscheinungsbild von C57BL / 6 Inselchen bei 24 Stunden nach der Isolierung. Bilder wurden auf einem in erworbenenumgewandelt Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Abbildung 3. Glukose-stimulierte Insulinsekretion von C57BL / 6 Inselchen. Nach 24 h nach der Isolierung wurden 100 Inselchen in einer 12-Well-Platte für 1 h bei 37 ° C in Krebs-Ringer-HEPES-gepufferten Lösung, enthaltend 2,5 mM Glucose inkubiert. Inseln wurden dann mit Krebs-Ringer-HEPES bei 2,5 mM Glucose für eine zusätzliche Stunde, wonach der Überstand für Insulin-Messung gesammelt übertragen wurde unter Verwendung eines Two-Site immunspezifische enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA) (Kristall Chem). Dieselben Inseln wurden anschließend Krebs-Ringer-HEPES-gepufferten Lösung, die 25 mM Glucose überführt und Insulinfreisetzung in das Medium wurde durch ELISA nach 1 Stunde Inkubation gemessen.