Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

1. Sonda de Diseño Diseño anti-sentido ADN embaldosado sondas para la recuperación selectiva del ARN diana por Chirp. Diseño anti-sentido sondas de oligonucleótidos mediante el diseñador de la sonda en línea en singlemoleculefish.com 18. Utilice los siguientes parámetros: número de sondas = 1 sonda / 100 pb de longitud ARN, 2) el objetivo% GC = 45, 3) longitud del oligonucleótido = 20, 4) de longitud Espacio = 60-80. Romper el ARN en segmentos, si es demasiado larga para el diseñador. Omitir las regiones de repeticiones o extensa homología. Orden anti-sentido sondas de ADN con BiotinTEG a las 3 de alto riesgo extremo. Sondas de etiqueta de acuerdo con sus posiciones a lo largo del ARN. Separarlos en dos grupos para que el "par" de piscina contiene todas las sondas de numeración 2, 4, 6, etc, y el "extraño" de piscina contiene sondas de numeración 1, 3, 5, etc Diluir grupo de sondas a la concentración mM 100 y almacenar a -20 ° C. Todos los experimentos se realizaron utilizandoambos grupos, que sirven como controles internos para los demás. Real RNA-dependiente de la señal estará presente en las dos piscinas, mientras que la sonda específicos de ruidos será único para cada piscina. Esto se aplica tanto para CHIRP-qPCR y CHIRP ss. 2. Las células de la cosecha Recoger las células que serán usadas en el experimento CHIRP. Se cultivan las células en placas de cultivo de tejidos o frascos a la confluencia. Enjuague con tampón fosfato salino (PBS) de una vez trypsinize. Apaga la tripsina con un volumen de> 2 veces los medios de comunicación, la pipeta hacia arriba y abajo para separar las células y resuspender en suspensión de células individuales. Transfiera todos los medios de comunicación y las células resuspendidas en 50 ml tubos Falcon. 20 millones de células son normalmente suficientes para una muestra Chirp. Derivado células en 800RCF durante 4 min. Aspirar y medios Resuspender las células en 40 millones de 40 ml de PBS, se combinan los tubos si es necesario. Derivado células en 800RCF durante 4 min. Decantar PBS, cuidadosamente aspirar en un ángulo del líquido restante. </ol> 3. Enlace de la Cruz-Las células y recoger sedimento celular Crosslink recogen las células con glutaraldehído para preservar la cromatina-ARN interacciones y preparar sedimento celular. Siga todos los pasos a temperatura ambiente. Preparar 1% de glutaraldehído en PBS temperatura ambiente. Preparar 10 ml por 10 millones de células (0,4 ml de 25% de valores glutaraldehído + 9,6 ml de PBS). El glutaraldehído debe ser utilizado fresco. Toque en la parte inferior de los tubos Falcon para desalojar gránulos. Resuspender pellet de células en 1% de glutaraldehído, comenzando con un pequeño volumen para evitar trozos, luego arriba hasta el volumen completo. Invertir para mezclar. Crosslink durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador de extremo a extremo o rotador. Sofocar la reacción de reticulación con el volumen 1/10o de 1,25 M de glicina a temperatura ambiente durante 5 min. Girar a 2000RCF durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y el precipitado lavado con 20 ml de PBS enfriado una vez, girando a 2000RCF durante 5 min. Aspirar y resuspender el wincinera, reticulado precipitado con 1 ml de PBS enfriado por 20 millones de células. Transfiera cada ml a un tubo Eppendorf y giran a 2000RCF durante 3 min a 4 ° C. Quite la mayor cantidad posible con PBS punta de la pipeta con cuidado. Flash congelar los gránulos de las células en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C indefinidamente. 4. Lisis de la célula Lisar células reticuladas para preparar lisado celular. Descongele gránulos congelados de células a temperatura ambiente. Toque duro para desalojar y mezclar el sedimento celular. Girar por la pastilla en el 2000RCF durante 3 min a 4 ° C. Utiliza la esquina 10 l punta de la pipeta para eliminar cualquier resto de PBS. En una balanza electrónica (precisión de 1 mg) de tara la masa de un vacío tubo Eppendorf (los tubos pesan 1.060 gramos forma muy consistente). Pese cada pastilla y registrar su peso. Un total de 15 cm plato de células HeLa reticulados normalmente pesa 100 mg. Suplemento tampón de lisis (10 veces la masa de sedimento, por ejemplo, 1 ml de 100 mg) con Fresh inhibidor de la proteasa, PMSF y SUPERase en (véase la lista adjunta de búfer). Mezclar bien. Añadir un volumen 10 veces complementado tampón de lisis a cada tubo y resuspender el precipitado. Para pequeños gránulos <25 mg, resuspender en 250 l de amortiguación complementado lisis. la suspensión debe ser lisa. si no es así, dividir 500 ml alícuotas y utilizar un motor mezclador pellets para disgregar los grumos. proceder inmediato a tratamiento con ultrasonidos. 5. sonicación adn cizallamiento por reticuladas lisados ​​celulares. someter ultrasonidos lisado celular bioruptor 15 tubos falcon. utilice <1,5 cada tubo, acelerar sonicación, sonicar más dos vez. baño agua 4 ° c posición alta 30 segundos on, off 45 intervalos pulso. compruebe minutos. continuar sonicando hasta que el células ya se turbia. esto puede tomar tan poco como minutos horas 4. númerode tubos, volumen muestra, temperatura del baño, período tiempo afectará cuánto toma proceso. probablemente ritmo diferente, así piscina juntos redistribuir originales asegurar homogeneidad. nota: glutaraldehído reticulado toman mucho equivalentes formaldehído. al vuelve clara, transferir 5 tubo eppendorf. añadir 90 proteasa k (pk) buffer (véase lista amortiguación) pk l. vortex mezclar centrifugar brevemente. incubar durante min 50 c. extraer kit qiagen purificación pcr. eluye elución (eb) comprobar tamaño adn, 1% gel agarosa. frotis grueso 100-500 pb, completa. continúe las muestras 16100rcf 10 combine sobrenadantes, 1 flash congelación nitroge líquidon. conservar -80 º 6. chirp hibridar sondas biotiniladas arn aislar cromatina enlazado. descongele ambiente. prepare tampón hibridación buffers, preparar 2 cromatina). mezclar. una muestra típica utilizando lisado, quitar input entrada lugar mantener hielo su uso posterior. tubo. total ml, nanodrop cantidad lo ha usado (100 um deberían especificaciones ~ 500-600 ng > representa el flujo de trabajo CHIRP. Un experimento CHIRP éxito típicamente enriquece ARN diana significativamente más ARNs no específicos. Figura 2 muestra el enriquecimiento de la telomerasa humana ARN (TERC) a partir de células HeLa por GAPDH, un ARN abundantes celulares que sirve como un control negativo. La mayoría de los ARNs TERC (~ 88%) presentes en la célula se empujado hacia abajo por la realización de chirrido, mientras que sólo el 0,46% de GAPDH RNA fue recuperada, demostrando un factor de enriquecimiento de ~ 200 veces. Las sondas no específicas, tales como sondas dirigidas LacZ ARN, que no se expresa en células de mamíferos (Figura 2), se puede utilizar como controles negativos adicionales. Regiones de ADN esperados de obligar a la lncRNA objetivo son típicamente enriquecida sobre regiones negativos cuando se mide por qPCR. Figura 3 muestra la validación qPCR de cuatro AIRE CALIENTE enlazados a sitios en fibroblastos primarios de prepucio humano que determina realizando CHIRP-ss en la misma línea celular, mientras que TERC y GAPDH ADN sitios sírve como regiones de control negativo. Tanto el "par" y la sonda "raro", establece el enriquecimiento producido comparable de plazos previstos AIRE CALIENTE-sitios a través de las regiones negativas, un sello distintivo de los verdaderos lncRNA sitios de unión. De alto rendimiento de secuenciación de ADN CHIRP enriquecido se obtiene un mapa global de los sitios de unión lncRNA. La Drosophila lncRNA roX2 se sabe que interactúan con el cromosoma X en una forma que se requiere para la compensación de la dosis. La Figura 4 muestra roX2 perfil de unión sobre una sección del cromosoma X. Tanto "incluso" y "extraño" las muestras han sido secuenciados y sus únicos ruidos han sido eliminados para producir un registro de las señales superpuestas. Cada "pico" aquí indica un sitio fuerte de roX2 vinculante. La pista completa y la lista de roX2 genes diana se han descrito en Chu et al. 2011 17. Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento CHIRPDuré. La cromatina se entrecruza con lncRNA: aductos de proteínas in vivo Biotinylated sondas suelo de baldosas se hibridan para apuntar lncRNA, y los complejos de la cromatina se purifica mediante perlas magnéticas estreptavidina, seguido de lavados rigurosos.. Nos eluir el ADN o las proteínas lncRNA unido con un cóctel de RNasa A y H. se esquematiza una supuesta secuencia de lncRNA vinculante en color naranja. Anteriormente publicado en Chu et al. 2011. 17 Figura 2. CHIRP enriquece de ARN humano TERC. TERC-asDNA sondas recuperar ~ 88% de los celulares TERC RNA no detectable y GAPDH. LacZ asDNA sondas se utilizaron como controles negativos y recuperar ni ARN. La media ± desviación estándar se muestran. Anteriormente publicado en Chu et al. 2011. 17 Figura 3. AIRE CALIENTE CHIRP-qPCR en humanos primariafibroblastos Eskin. NFKBIA, HOXD3 4, SERINC5 y ABCA2 son las regiones que interactúan con AIRE CALIENTE. TERC y GAPDH sirvieron como controles negativos. La media ± desviación estándar se muestran. Anteriormente publicado en Chu et al. 2011. 17 Figura 4. CHIRP-ss datos de roX2 ARN en células de Drosophila SL2. "Aún" y "extraño" fueron secuenciados por separado, sus datos se unen para reflejar sólo los picos comunes en ambos. La pista fusionada se muestra. Anteriormente publicado en Chu et al. 2011. 17