軟体動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ<em>アメフラシ</em
Summary
我々は、細胞内遊離カルシウム濃度とシナプス伝達効率の変化が同時にのガングリオンの準備で監視する方法を示し<em>アメフラシ</em>。我々は、蛍光染料を使用して画像内カルシウム、カルシウムオレンジ、シャープ（細胞内）電極を用いたシナプス伝達を誘導し、監視します。
Abstract
これは、細胞内カルシウムの変化はシナプス可塑性の重要な形態（例えば、homosynaptic促進）1の数の誘導を仲介することが示唆されている。これらの仮説は、同時に細胞内カルシウムの変化とシナプス伝達効率の変化を監視することによってテストすることができます。我々は、これは細胞内記録技術とカルシウムイメージングを組み合わせることによって達成することができる方法を示しています。我々の実験は、軟体動物アメフラシcalifornicaの頬神経節で行われている。この準備は、実験的に有利な多くの特長を備えています：Gangliaのは容易アメフラシから削除され、実験は通常のシナプス結合を作ると、通常のイオンチャネルの分布を持っている成人のニューロンを使用することができます。 アメフラシのために自然である動物の低代謝率と比較的低い温度（14-16℃）のために、準備が長時間安定しています。
ENT ">我々は簡単にイオントフォレーシスを介したニューロンに"読み込まれる"カルシウムオレンジ2の細胞透過性のバージョンを使用します。この長波長蛍光色素はカルシウムに結合すると、蛍光強度が増加し細胞内遊離カルシウムの変化を検出するためにはカルシウムオレンジありレシオメトリック色素（例えば、フラ2）とは異なり、高速の速度論的性質3とは、イメージングのためのフィルターホイールを必要としません。それは安定したかなりの写真や他の色素（例えば、フルオ3）2,4未満光毒性です。すべての非レシオメトリックと同様に染料、カルシウムオレンジはカルシウム濃度の相対的変化を示していますしかし、それはロードと拡散による色素濃度の変化を考慮することはできないので、それは絶対的なカルシウム濃度を提供するためにキャリブレーションすることはできません。直立、固定ステージ、複式顕微鏡は、毎秒30フレームの周りの記録が可能なCCDカメラで画像ニューロンに使用されていました。 アメフラシこの時間分解能で細胞内カルシウム濃度であっても単一のスパイク誘発性の変化を検出するために十分です。シャープ電極を同時に同定前とシナプス後ニューロンにシナプス伝達を誘導し、記録するために使用されます。各試験の結論では、カスタムスクリプトは、電気生理学やイメージングのデータを結合します。適切な同期を確実にするために、我々は顕微鏡のカメラポートに搭載されたLEDからの光パルスを使用しています。シナプス前カルシウムレベル（細胞内EGTA注射を介してなど）の操作は、私たちは様々な形態の可塑性を媒介する細胞内カルシウムの役割に関する具体的な仮説をテストすることができます。
Protocol
Discussion
我々は同時に、細胞内カルシウム濃度を監視し、シナプス伝達の有効性を評価するために用いることができるテクニックを紹介します。これらの技術は、短期可塑性の様々な形態が仲介されているどのように判断するのに役立ちます。
イメージングは蛍光顕微鏡とCCDカメラを用いて行われる。ほとんどの機能イメージングのセットアップと比較した場合、これらの?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PHSのグラント（MH51393）は、この作業を支持した。我々が使用するアメフラシの一部は研究資源は、NIHのナショナルセンターからの助成金RR10294下マイアミ大学のアメフラシのための国家リソースによって提供されています。
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue Number | Comment |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M0250 | used in 0.33 M solution to anesthetize animal |
Table 1. Reagents used.
| Equipment Name | Company | Comment |
| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | |
| NIS elements AR (version 3.22) |
Nikon Instruments | imaging software used to acquire fluorescence data |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging |
| LS-DWL halogen lamp |
Sumica | |
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | |
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz |
| Spike II (version 7.07) |
Cambridge Electronic Design | software used to acquire electrophysiology data |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate |
Table 2. Equipment used.
Referenzen
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