رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وفعالية متشابك في الرخويات<em> Aplysia</em
Summary
نبين كيف يمكن تغيير في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحرة وفعالية متشابك رصد في وقت واحد في إعداد عقدة<em> Aplysia</em>. نحن صورة الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام صبغة الفلورسنت، أورانج الكالسيوم، وحمل ومراقبة انتقال متشابك مع الأقطاب الكهربائية (داخل الخلايا) حادة.
Abstract
وقد اقترح أن التغييرات في الكالسيوم داخل الخلايا توسط في تحريض عدد من الأشكال الهامة من اللدونة متشابك (على سبيل المثال، وتيسير homosynaptic) 1. يمكن اختبار هذه الفرضيات من خلال رصد التغيرات في وقت واحد في الكالسيوم داخل الخلايا وإحداث تغييرات في فعالية متشابك. نحن توضح كيف يمكن تحقيق ذلك من خلال الجمع بين التصوير مع الكالسيوم داخل الخلايا تقنيات التسجيل. وتجرى التجارب لدينا في العقدة الشدق من californica Aplysia الرخويات. هذا المستحضر يحتوي على عدد من الميزات تجريبيا المفيد: يمكن إزالتها بسهولة من العقد والتجارب Aplysia استخدام الخلايا العصبية التي تجعل الكبار اتصالات متشابك العادية ويكون لها قناة ايون العادية التوزيع. نظرا لانخفاض معدل الأيض للحيوان ودرجات حرارة منخفضة نسبيا (14-16 ° C) التي هي طبيعية للAplysia .. يجري مستقرة لفترات طويلة من الزمن.
الأنف والحنجرة "> للكشف عن تغيرات في الخلايا الكالسيوم الحرة سوف نستخدم النسخة المحمولة من impermeant أورانج الكالسيوم (2) الذي هو بسهولة 'تحميل' إلى الخلايا العصبية عن طريق الرحلان الشاردي. هذه الصبغة عندما الطول الموجي الطويل الفلورسنت يربط الكالسيوم، ويزيد من كثافة مضان. أورانج الكالسيوم لديها خصائص الحركية بسرعة 3 و، على عكس الأصباغ ratiometric (على سبيل المثال، FURA 2)، لا يتطلب أي مرشح عجلة للتصوير، وهي الصورة إلى حد ما مستقرة وأقل من الأصباغ سمي ضيائي الأخرى (على سبيل المثال، فلوو-3) 2،4. مثل كل ratiometric غير الأصباغ، البرتقالية الكالسيوم يشير التغيرات النسبية في تركيز الكالسيوم، ولكن لأنه ليس من الممكن لحساب التغيرات في تركيز صبغة بسبب التحميل ونشرها، فإنه لا يمكن معايرتها لتوفير تركيزات الكالسيوم مطلقة.تم استخدام، ثابتة تستقيم المجهر المركب المرحلة، إلى الخلايا العصبية الصورة مع كاميرا CCD قادر على تسجيل نحو 30 لقطة في الثانية. في Aplysia هذا القرار الزمانيهي أكثر من كافية للكشف عن تغيير واحد حتى الناجم عن ارتفاع في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. وتستخدم في وقت واحد أقطاب حادة للحث على نقل وتسجيل متشابك الخلايا العصبية التي تم تحديدها في مرحلة ما قبل وبعد المشبكي. في ختام كل محاكمة، برنامج نصي مخصص يجمع بين الكهربية وتصوير البيانات. لضمان التزامن المناسب نستخدم نبضة ضوء LED من تقام في ميناء الكاميرا من المجهر. التلاعب في مستويات الكالسيوم قبل المشبكي (على سبيل المثال عن طريق حقن الخلايا EGTA) يسمح لنا لاختبار الفرضيات محددة، فيما يتعلق بدور الكالسيوم داخل الخلايا في التوسط أشكال مختلفة من اللدونة.
Protocol
Discussion
علينا أن نبرهن التقنيات التي يمكن استخدامها في وقت واحد لمراقبة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وتقييم فعالية انتقال متشابك. هذه التقنيات مفيدة لتحديد كيفية توسط أشكال مختلفة من قصيرة الأجل اللدونة.
ويتم التصوير بها مع مضان المجهر…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد PHS غرانت (MH51393) هذا العمل. وتقدم بعض Aplysia نستخدمها من قبل الموارد الوطنية للAplysia من جامعة ميامي في إطار المنحة RR10294 من المركز الوطني للبحوث الموارد، NIH.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue Number | Comment |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M0250 | used in 0.33 M solution to anesthetize animal |
Table 1. Reagents used.
| Equipment Name | Company | Comment |
| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | |
| NIS elements AR (version 3.22) |
Nikon Instruments | imaging software used to acquire fluorescence data |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging |
| LS-DWL halogen lamp |
Sumica | |
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | |
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz |
| Spike II (version 7.07) |
Cambridge Electronic Design | software used to acquire electrophysiology data |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate |
Table 2. Equipment used.
Referenzen
- Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).
- Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis. Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).
- Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons. J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).
- Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission. J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).
- Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation. J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).
- Haugland, R. P. . The Handbook. , (2005).
- Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia. J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).
