De kwaliteit van muizen embryonische fibroblasten (MEF) wordt bepaald door de juiste spanning van muis zoals CF-1. Pluripotentie-ondersteunende MEFs en geconditioneerde media (CM), verkregen van deze moeten bevatten optimale concentraties van Activin A, Gremlin en Tgfβ1 nodig is voor de Activin / Nodal en FGF wegen naar co-operatief te behouden zelfvernieuwing en pluripotentie.
In het algemeen menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) en humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) 1 kunnen worden gekweekt onder wisselende omstandigheden. Het is echter niet eenvoudig om een effectief voor het kweken van deze cellen. Omdat de kweekomstandigheden van invloed kunnen zijn expressie van genen die verleent pluripotentie in hESC 's en hiPSCs, de optimalisatie en standaardisatie van de kweekmethode is cruciaal.
De instelling van hESC lijnen werd beschreven door MEF als feeder cellen en foetaal runderserum (FBS) bevattende kweekmedium 2. Vervolgens werd FBS vervangen door knock-out serum vervanging (KSR) en FGF2, die verspreiding van hESC 's 3 verbetert. Tot slot, feeder-vrije cultuur systemen maken het mogelijk het kweken van cellen op Matrigel gecoate platen in KSR-bevattende geconditioneerd medium (medium bepaald door MEF) 4. Vervolgens hebben hESC 's kweekomstandigheden verhuisd naar feeder-vrije cultuur in chemisch defined omstandigheden 5-7. Bovendien hebben om de mogelijke besmetting door ziekteverwekkers en dierlijke eiwitten cultuur methoden met behulp van xeno-vrije componenten te voorkomen is opgericht 8.
Om betere voorwaarden te verkrijgen muis feeder-cellen zijn vervangen door menselijke cellijnen (bijvoorbeeld spier-en foetale huidcellen 9, volwassen huidcellen 10, voorhuid fibroblasten 11-12, vruchtwater mesenchymale cellen 13). Echter, de efficiëntie van de handhaving van ongedifferentieerde hESC 's met behulp van menselijke voorhuid fibroblast-afgeleide feeder lagen is niet zo hoog als dat van de muis feeder cellen als gevolg van het lagere niveau van de secretie van Activin A 14. Uiteraard is er een duidelijk verschil in groeifactor door muizen en mensen feeder cellen.
Analyses van de transcriptomen van muis en mens feeder-cellen aangetoond dat er belangrijke verschillen tussen de ondersteunende en niet-ondersteunende cellen. Exogene FGF2 is cruciaal voor maintaining zelf-vernieuwing van hESC 's en hiPSCs, en is geïdentificeerd als een belangrijke factor die de expressie van Tgfβ1, Activin A en Gremlin (een BMP-antagonist) in feeder-cellen. Activin A is aangetoond dat de expressie van OCT4, SOX2 en NANOG in hESC 's 15-16 induceren.
Voor de lange termijn cultuur, kan hESC 's en hiPSCs worden geteeld op mitotisch geïnactiveerd MEFs of onder feeder-vrije omstandigheden in MEF-CM (MEF-geconditioneerd medium) op Matrigel-gecoate platen om hun ongedifferentieerde toestand te houden. Succes van beide kweekomstandigheden volledig afhankelijk van de kwaliteit van de feeder cellen omdat invloed uitoefenen op de groei van hESC '.
Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor de isolatie en de cultuur van muis embryonale fibroblasten (MEF), voorbereiding van geconditioneerd medium (CM) en enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) om de niveaus van activine A in de media te beoordelen.
De MEF isolatieprocedure hier gepresenteerde maakt het opzetten van een gestandaardiseerde cultuur voorwaarde voor hESC 's en hiPSCs. Bovendien is de ELISA-systeem gebruikt cytokine productie beoordelen door feeder cellen is een bruikbare indicator van de kwaliteit van de MEF verkregen geconditioneerde media. De onderhoud van het muizenstam (CF1) voor de ondersteuning fibroblasten moet batch-tot-partij variatie van kweekmedia voorkomen. Bovendien is het aan te raden om embryo's te isoleren van meerdere muizen tegelijkertijd om een constante kwaliteit van de cellen te verkrijgen. Zeker vers geïsoleerde MEFs gehouden kunnen worden bevroren op P0 en P1. Ook geïnactiveerd MEF worden ingevroren in hoeveelheden van geschikte hoeveelheden afhankelijk van de eisen voor celkweek. Meestal ongeveer 250.000 cellen worden uitgeplaat in een put van een 6-wells plaat tot cultuur hESC 's en IPS-cellen. De gevestigde en geoptimaliseerd methode routinematig worden gebruikt om de verschillen tussen diffe minimaliserenhuren experimenten.
The authors have nothing to disclose.
Met dank aan dr. Boris Greber voor het opzetten van de Activin een ELISA-protocol, zoals gepubliceerd in Greber et al.. 2007. Wij zijn bijzonder dankbaar aan mevrouw Monica Shevack de voorbereiding van de grafisch overzicht. We zijn erg dankbaar dat dr. Heiko Fuchs voor alle hulp en waardevolle suggesties voor en tijdens het filmen. We willen alle leden van de Adjaye laboratorium, in het bijzonder Elisabeth Socha bedanken voor het handhaven van een constante aanvoer van MEFs en CM. Wij erkennen ook onze collega's van het dier faciliteit van de MPIMG voor hun blijvende steun. Dit werk werd mede gefinancierd door het Max Planck Instituut en de [BMBF; licentienummer 0315717A] en partners uit de ERASysBio + initiatief ondersteund door het EU ERA-NET Plus-regeling in KP7.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
FBS | Biochrom | S0115 | |
L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |