Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

1. Fare Embriyonik Fibroblastlar izolasyonu (MEFS) Aşağıdaki iki adım non-aseptik koşullar altında gerçekleştirilir. Servikal dislokasyon ile 13 veya 14 DPC (Günlük post-coitum) bir gebe fare (CF1, Harlan, ABD) Kurban. Uterus boynuzu dışarı dissect, kısa bir süre Ca2 + Mg 2 olmaksızın PBS içeren bir Falcon tüpe 70% (v / v) etanol ve yerinde durulama + (Gibco, Invitrogen). Aşağıdaki adımları aseptik koşullarda bir doku kültürü kaputu yürütülen ve steril aletler kullanıyor. Petri içine laparotomi yerleştirin ve plasenta ve embriyo kesesi her embriyo ayırın. Kafası ve kırmızı organları incelemek, PBS içinde yıkayın ve temiz bir petri tüm embriyolar yerleştirin. İnce bu Pipeti mümkün hale gelinceye kadar steril bir jilet kullanarak doku kıyma. % 0.05 1 ml ilave edilir tripsin / EDTA (Gibco, Invitrogen), incluembriyo başına DNaz I (USB) ding 100 Kunitz birimleri. Bir 50 ml Falcon tüpüne aktarılır ve doku 37 azından 15 dakika süreyle inkübe edilir ° C. Inkübasyon her 5 dakika sonra, iyice yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri ayrışır. Taze hazırlanmış MEF besiyeri yaklaşık 1 hacim ekleyerek tripsin inaktive. MEF kültür ortamı (bileşenler, medya, 500 ml oluşturan tüm bileşenler ve filtre karıştırmak için): 450 ml DMEM, FBS ve 50 ml (10% (v / v)), 200 mM L-glutamin (1/100 (v / v)) ve 5 ml penisilin-streptomisin 5 ml (1/100 (v / v)). 5 dk, (300 xg) düşük hız ile hücreler santrifüj, dikkatle sıcak MEF orta süpernatan ve Pastör pipetiyle hücre pelletini kaldırın. Levha yaklaşık 2 saat süreyle% 0.2 jelatin (büyükbaş hayvanların derilerinden, Tip B, Sigma jelatin) ile kaplanmış her T150 (TPP) şişeye 3-4 embriyo eşdeğer bir hücre sayısı. Fibroblastlar (P0, pasaj 0) jelatin kaplı matara eklemek için yeteneği var sadece hücrelerdir. </li> İdeal olarak, hücre 24 saat sonra% 80-90 konfluent olup, bu aşamada P0 hücrelerinin büyük bir kısmı gelecekteki kullanım için dondurulur. P3 veya P4 kadar P0 hücrelerin kalan T150 balonuna (ler) genişletin, sonra inaktive ve besleyiciler hESC replate veya klimalı ortamda (CM) üretmek için kullanın. 2. Inaktivasyonu ve Kaplama MEFS (Besleyici Hücreler Hazırlık) Tüm adımları aseptik koşullarda bir doku kültürü kaputu yapılmaktadır. En az 2 saat oda sıcaklığında% 0.2 jelatin ve inkübe ile kaplamak T150 şişeler. Mitomisin C PBS içerisinde (1 mg / ml) ve filtre ile seyreltilir. MEFS medya aspire ve Ca 2 + Mg 2 + PBS ile yıkayın. 10 mikrogram / MEFS üzerine mitomisin C ml içeren orta yeri 20 ml. 37 2 saat boyunca inkübe ° orta içeren mitomisin C ile C PBS, trypsinize, santrifüj (300 xg'de 5 dakika) ve sıcak ortamda Pastör pipetiyle hücreleri ile iki kez yıkayın. 56,000 hücre / T150 şişeler içerisinde cm 2 arasında bir yoğunlukta hücreleri ve plaka saymak ve aşağıdaki 6 gün boyunca CM üretimi için kullanımı. 3. Koşullu Orta (CM) hazırlanması Tüm adımları aseptik koşullarda bir doku kültürü kaputu yapılmaktadır. HESC ortamı (UM, doğuştan orta) (0.5 ml / cm 2) ile MEF orta yerine 56,000 hücre / cm 2 arasında bir yoğunlukta inaktive MEFS kaplama sonrası gün 4 ng / ml arasında FGF2 ile desteklenmiş taze. 24 saat inkübasyondan sonra besleyici matara gelen CM toplayın ve 4 ng / fiderlere FGF2 ml içeren taze hESC orta ekleyin. Gelecek 6 gün için bu yordamı yineleyin. Her gün mağaza -20 ° C'de CM toplanan 6 gün, orta ve filtre (Corning, 0.22 um, PAS) tüm alikotları karıştırın sonra. -80 Az 50 ml hacimde ve mağaza olun ° C Matrigel yetişen hESC eklemeden önce ek 4 ng / ml FGF2 CM tamamlayın. </ Li> 4. Koşullu ortam bir aktivin ölçümü (ELISA) 15 Tüm örnekler ve reaktifler oda sıcaklığına getirin. Mikroplaka eklemek,% 1 BSA ile PBS (İnsan \ Fare \ Rat aktivin A MAb, R & D Systems) antikor yakalamak (100 ul / kuyu) ve RT gece inkübe sulandırınız. 24 saat blok (% 1 BSA / PBS, 300 ul / kuyucuk) oda sıcaklığında 1 saat daha sonra PBST (% 0.05 Tween 20 ile PBS) (de 300 ul /) ile üç kez kuyuları yıkayıp sonra. Bu süre içinde bir aktivin A 7 dilüsyonları (30 ng / ml konsantrasyonu daha az) ve boş bir örnek de dahil olmak üzere (R & D Systems) standart eğri, hazırlamak. Aktivin doğrusal çalışma aralığı 0.25 ile 32 ng / ml 'dir. Kuyular (iyi 100 ul /) için standartlar ve örneklerin kopyası ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Kuyu üç kez (PBST 300 ul) yıkayın. Ikincil (biyotin) antikoru (İnsan / Fare / Rat aktivin A MAb, R & D Systems biyotinile) (0 ekleyin.25 ug / ml% 1 BSA / PBS) ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edilir. Kuyu üç kez (PBST 300 ul) yıkayın, Streptavidin-HRP (% 1 BSA / PBS, R & D Systems ile sulandırılmış) ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Kuyu üç kez (PBST 300 ul) yıkayın, substrat çözeltisi 100 ul (Quantikine, R & D Systems) ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. Her bir kuyuya durak çözüm 100 ul (Quantikine, R & D Systems) ekleyin ve hafifçe karıştırın. De her optik yoğunluğu belirlemek için 540 veya 570 nm dalga boyu düzeltmesi ile 450 nm Set Mikroplaka okuyucu (Molecular Devices Spectra Max 250, Global Tıbbi Cihazlar A.Ş., Minnesota),. 5.. Temsilcisi Sonuçlar Izolasyon prosedürü genel şeması Şekil 1'de verilmiştir. HESC ve farklı koşullar altında kültüre hiPSCs tipik morfolojisi Şekil 2'de sunulmuştur. Morfolojisi MEFS ve CM hazırlamak için kullanılan inaktif besleyici hücreler Şekil 3'te sunulmuştur. Genel olarak, hücreler 24 saat sonrası izolasyon konfluant ve dondurulmuş veya genişletilebilir hazır olmalıdır. Ancak, bazen bu birleşik kültürler almadan önce 2-3 gün sürebilir. CM pasaj 4 değil, daha az hücrelerden hazırlanır. Primer hücreler sadece yaşlılık başlangıcı önce 4-5 geçişleri için açılabilir, çünkü bu çok önemlidir. Sitokin, aktivin A, pluripotent hücreler 14 farklılaşmamış büyüme desteği için besleyici hücreler tarafından salgılanan en önemli faktör olarak kabul edilir. CM A aktivin düzeyinin ölçümü (Şekil 4) MEFS kalitesini izlemek için çok uygun bir kantitatif bir testtir. Şekil 1. MEFS izolasyon prosedürü şematik gösterimi. ontent "> Şekil 2,. (A) besleyici hücre, (B) şartlandırılmış orta ve (C) orta tanımlandığı varlığında kültüre andiferansiye hESC tipik morfolojisi. (D, E) besleyici hücre varlığında kültüre hiPSCs tipik morfolojisi. Şekil 3. Fare embriyonik fibroblast tipik morfolojisi (MEFS). (A) Passage 0 (P0) kaplama / izolasyon iki gün sonra, 56.000 hücre / cm yoğunluğu (B) inaktive besleyici tabaka. 2 Şekil 4. Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) tabanlı klimalı ortamda (CM) pr bir aktivin konsantrasyonu ölçümleriCF1 fare soyundan türetilmiş fare embriyonik fibroblastlar ile epared. CM 6 gün boyunca toplandı ve ardından birleştirilmiş edildi. CM "1" ve CM "2" medya ve şartsız medyaya UM farklı gruplar bakın. Conditioning işleminin fonksiyonu MEFS, aktivin tarafından aracı madde içine bir salgılama aktivin gibi bir UM hemen hemen mümkün değildir.