Summary

Imaging quantitativa di Lineage specifici Toll-like receptor-mediate Signaling in monociti e cellule dendritiche da piccoli campioni di sangue umano

Published: April 16, 2012
doi:

Summary

Descriviamo l'uso della tecnologia ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), Che combina quantitative citometria di flusso con simultanea alta risoluzione digital imaging, per quantificare i meccanismi cellulari di cellule immunitarie primarie da ben definiti coorti di pazienti. I nostri studi forniscono un modello per le indagini traslazionali quantificare lignaggio risposte specifiche cellulari a piccoli campioni di coorti di soggetti.

Abstract

Variazioni individuali nel determinare le risposte stato immunitario alle infezioni e contribuire alla gravità della malattia e il risultato. L'invecchiamento è associato ad un aumento della suscettibilità alle infezioni virali e batteriche e diminuita capacità di risposta ai vaccini con un ben documentato calo umorale e cellulo-mediata 1,2 immune risposte. Abbiamo recentemente valutato gli effetti dell'invecchiamento sulla recettori Toll-like (TLR), componenti chiave del sistema immunitario innato che rilevano l'infezione microbica e di trigger antimicrobici risposte di difesa dell'ospite 3. In un'ampia coorte di donatori umani sani, abbiamo dimostrato che i monociti di sangue periferico di pazienti anziani hanno una ridotta espressione e la funzione di alcuni TLR 4 e simili livelli di TLR ridotti e le risposte di segnalazione nelle cellule dendritiche (DC), cellule presentanti l'antigene che sono fondamentale nella il collegamento tra immunità innata e adattativa 5. Abbiamo dimostrato di disregolazione TLR3 nei macrofagi unod minore produzione di IFN da parte di DCS donatori anziani in risposta ad infezione da West Nile virus 6,7.

Paramount alla nostra comprensione del immunosenescenza e di intervento terapeutico è una comprensione dettagliata di specifici tipi cellulari che rispondono e il meccanismo di (s) di trasduzione del segnale. Gli studi tradizionali di risposte immunitarie, attraverso l'imaging di cellule primarie e marcatori cellulari di rilevamento di FACS o immunoblot hanno avanzato la nostra comprensione significativo, tuttavia, questi studi sono generalmente limitati tecnicamente dal volume piccolo campione a disposizione di pazienti e l'incapacità di condurre complesse tecniche di laboratorio su più campioni umani. ImageStream combina citometria a flusso con quantitativa simultanea digitale ad alta risoluzione di immagini e quindi facilita indagine in popolazioni di cellule multiple contemporaneamente per una acquisizione efficace della sensibilità del paziente. Qui si dimostra l'uso di ImageStream nei PVS per valutare TLR7 / 8attivazione-mediate aumento nella fosforilazione e traslocazione nucleare di un fattore di trascrizione chiave, NF-KB, che inizia la trascrizione di numerosi geni che sono critici per le risposte immunitarie 8. Grazie a questa tecnologia, abbiamo anche recentemente dimostrato una alterazione precedentemente non TLR5 di segnalazione e il pathway NF-kB nei monociti da donatori anziani, che possono contribuire a una risposta immunitaria alterata nell'invecchiamento 9.

Protocol

1. L'isolamento e la stimolazione delle cellule immunitarie Ottenere 10-50 ml di sangue eparinizzato da volontari sani, dopo consenso informato scritto in base alle direttive del consiglio locale Institutional Review. Per gli studi di invecchiamento o di malattia patogenesi, criteri di esclusione e di inclusione per ciascun volontario o il paziente deve essere esplicitamente determinato. Isolate cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) che utilizzano tubi o CPT Ficoll-Paque Inoltre seco…

Discussion

I passaggi critici in uso di ImageStream per gli studi traslazionali sono la selezione dei gruppi di confronto rilevanti e l'ottimizzazione e la convalida delle specificità anticorpale. Le differenze tra i gruppi di soggetti nel bersaglio marcato saranno subito evidenti attraverso istogrammi e le immagini di cellule. In combinazione con un'analisi approfondita dei cambiamenti nei recettori rilevanti e vie di segnalazione, questi dati forniranno informazioni preziose sui meccanismi che sono alla base disregolazi…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato in parte dal NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089.992, e il NCRR / GCRC Programma M01-RR00125). Gli autori dichiarano di non conflitto di interessi finanziari e ringraziare il Dr. Mark Shlomchik, direttore del Fondo Anima a celle Yale Sorter.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
R848 Invivogen tlrl-r848
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
BD Perm/Wash BD Biosciences 554723
CD14-PE eBioscience 12-0149-41
CD4-PacBlue BD Pharmingen 68436
Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC BD Biosciences 340546
CD11c-PE BD Biosciences 347637
CD123-PE BD Biosciences 340545
rabbit anti-NF-κB (p65) SantaCruz SC-372
Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG Invitrogen A21246
DAPI Invitrogen D21490
ImageStream X Amnis  

Table 1. Specific reagents and equipment.

Cell type FITC PE Alexa 647 PacBlue
Monocyte   CD14 NF-κB (p65)  
mDC Lin1 CD11c NF-κB (p65) CD4
pDC Lin1 CD123 NF-κB (p65) CD4

Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways

Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.

Referenzen

  1. Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
  2. Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
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  6. Kong, K. -. F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
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  10. George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).

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Diesen Artikel zitieren
Qian, F., Montgomery, R. R. Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood. J. Vis. Exp. (62), e3741, doi:10.3791/3741 (2012).

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