Monstervoorbereiding van<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Extracten voor Nuclear Magnetic Resonance metabolietvorming
Summary
De metaboloom profiel van<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Bepaald na groei in bouillon kweken. Voorwaarden kan worden gevarieerd om het effect van voedingssupplementen, oxidanten en anti-tuberculose middelen te testen op de metabolische profiel van dit micro-organisme. Procedure voor het extract voorbereiding is van toepassing voor zowel 1D<sup> 1</sup> H en 2D<sup> 1</sup> H-<sup> 13</sup> C NMR analyses.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis is een belangrijke oorzaak van sterfte in de mens op wereldschaal. De opkomst van zowel multi-(MDR) en uitgebreid-(XDR) resistente stammen dreigt te ontsporen huidige ziekte controle-inspanningen. Er is dus een dringende behoefte aan geneesmiddelen en vaccins die effectiever dan de huidige ontwikkelen. Het genoom van M. tuberculose is gekend voor meer dan 10 jaar, maar toch zijn er belangrijke hiaten in onze kennis van gen-functie en wezenlijkheid. Vele studies hebben sindsdien gebruikt genexpressieanalyse zowel het transcriptoom en proteomische niveaus om de effecten van drugs, oxidatiemiddelen en groeiomstandigheden de algemene patronen van genexpressie te bepalen. Uiteindelijk wordt de uiteindelijke reactie van deze veranderingen weerspiegeld in de metabole samenstelling van de bacterie waaronder enkele duizenden kleine molecuul gewicht. Vergelijken van de metabolische profielen van wildtype en mutante stammen, hetzij onbehandeld of treated met een bepaald geneesmiddel kan efficiënt in doelbepaling en kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe remmers met anti-tbc activiteit. Ook kunnen de effecten van twee of meer voorwaarden metaboloom worden beoordeeld. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) is een krachtige techniek die wordt gebruikt voor het identificeren en kwantificeren metabole intermediairen. In dit protocol, de procedures voor de opstelling van M. tuberculose celextracten voor NMR metaboloom analyse worden beschreven. Celculturen worden gekweekt onder geschikte omstandigheden en vereist Biosafety Level 3 containment, 1 geoogst en onderworpen aan mechanische lysis behoud koude temperaturen bewaring van metabolieten maximaliseren. Cellysaten worden teruggewonnen, gefiltreerd gesteriliseerd en opgeslagen bij zeer lage temperaturen. Aliquots van deze celextracten worden uitgeplaat op Middlebrook 7H9 agar voor kolonievormende eenheden geen levensvatbare cellen te verifiëren. Na twee maanden incubatie bij 37 ° C, indien geen vikunnen kolonies worden waargenomen, worden monsters uit de opvangvoorziening voor verdere verwerking. Extracten worden gevriesdroogd, geresuspendeerd in gedeutereerd buffer en geïnjecteerd in de NMR instrument, vastleggen spectroscopische gegevens die vervolgens wordt onderworpen aan statistische analyse. De beschreven procedures kunnen worden toegepast voor zowel eendimensionale (1D) 1H NMR en tweedimensionale (2D) 1 H-13 C NMR analyses. Deze methode levert meer betrouwbare kleine molecuulgewicht metaboliet identificatie en meer betrouwbare en gevoelige kwantitatieve analyse van celextract metabolische samenstellingen dan chromatografische methoden. Variaties van de beschreven procedure na cellyse stap kan ook worden aangepast voor parallel proteoomanalyse.
Protocol
Discussion
Een groot aantal studies hebben de transcriptoom-en proteoomanalyse profielen van M. tuberculose onder verschillende in vitro en in vivo omstandigheden. 11-16 uiteindelijk veranderingen in genexpressie en enzymactiviteit leiden tot variaties in de concentraties van kleine moleculen molecuulgewicht. De volledige beschrijving van deze verbindingen vormt het metaboloom. Aldus kunnen de effecten van drugs en wisselende groeiomstandigheden op metabolisme gevolgd door metabolische a…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag alle leden van de laboratoria van Dr Barletta en Dr Powers bedanken voor nuttige opmerkingen bij het ontwikkelen van het protocol. Wij danken Wendy Austin voor nuttige discussies en proeflezen van het manuscript. Het werk beschreven in dit manuscript werd gefinancierd door zaad piloot de subsidie voor elke onderzoeker hierboven genoemde aan de Universiteit van Nebraska-Lincoln Redox Biology Center (ouder subsidie # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI). Daarnaast danken wij dr. Ofelia Chacon voor het verstrekken van financiële middelen uit haar R21 subsidie (1R21AI087561-01A1) voor onderzoek leveringen en gedeeltelijke salaris heer Halouska de steun aan NMR-technieken in deze publicatie te standaardiseren.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| ADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212352 | |
| BACS-120 Sample Changer | Bruker | ||
| Bruker Avance NMR | Bruker | 500 MHz | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Fraction V |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | Benchtop |
| Centrifuge Tubes | Corning | 430291 | 50 ml sterile polypropylene |
| Cryogenic Vials | Corning | 430488 | 2.0 ml sterile polypropylene |
| Cycloheximide | A.G. Scientific | C-1189 | Toxic |
| D(+) – Glucose | ACROS | 41095-0010 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385 | |
| Erlenmeyer Flask | VWR | 89095-266 | Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap |
| Flash Freeze Flask | VWR | 82018-226 | 750 ml |
| Freeze Dryer | VWR | 82019-038 | 4.5 L Benchtop |
| Glycerol | GibcoBRL | 15514-029 | |
| Incubator | New Brunswick | Innova 40 | Benchtop shaker |
| Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911-100 | |
| Lysis Machine | MP Biomedicals | FastPrep-24 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | Benchtop |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | Benchtop |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco | 271310 | |
| NMR tubes | Norell | ST500-7 | 5mM |
| OADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212351 | |
| Oleic Acid | Sigma | O1008 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | VWR | BDH0266 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR | BDH0268 | |
| Rotor – Microfuge 22R | Beckman Coulter | F241.5P | Sealed and polypropylene |
| Rotor – Allegra X-15R | Beckman Coulter | SX4750 | With bio-certified covers |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 | Cambridge Isotope | DLM-48 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU-530 | |
| Spectrophotometer Cuvettes | LifeLINE | LS-2410 | 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides |
| Syringe | Becton Dickinson | 309585 | Sterile, 3 ml Luer-Lok |
| Syringe Filter | Nalgene | 190-2520 | 0.2 μm sterile cellulose acetate |
| Tween 80 | Fisher Scientific | BP338-500 |
Referenzen
- Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2 (2007).
- Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1 (2007).
- Clarridge, J. E., Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
- Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
- Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
- Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
- Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
- Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
- Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
- Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
- Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
- Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
- Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
- Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
- Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
- Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
- Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
- Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
- Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
- Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
- de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
- de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
- Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
- Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
- Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
- Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
- Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
- Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
- Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
- Simpson, R. J., Inglis, J. . Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. , 425-595 (2003).
- Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
- Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. , (2011).
- Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).
- Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).
