Summary

특정 유전자의 Overexpression 또는 최저 후 라모스의 B 세포에서 체세포 Hypermutation을 평가

Published: November 01, 2011
doi:

Summary

우리는 overexpression 또는 shRNA 함유 인간 라모스 B – 세포주에서 어떻게 이러한 세포에 체세포 hypermutation를 측정하는 구성합니다.의 retroviral 또는 lentiviral 감염을 수행하는 방법을 설명합니다

Abstract

B 세포는 V (D) J 재조합에 의해 생성된 낮은 친화 항체와 그들의 인생을 시작합니다. 그러나 병원체를 감지시, 면역 글로불린 (IG) 유전자의 변수 (V) 지역은 높은 친화 항체 1,2의 결과로, 약 100,000 배 더 체세포 hypermutation (SHM)을 통해 게놈의 나머지 부분보다 변이이다. 또한, 클래스 스위치 재조합 (CSR)은 특정 병원체에 대한 필요한 면역 반응의 종류에 따라 다른 이펙터 기능을 가진 항체를 생산하고 있습니다. CSR과 SHM 모두 uracils 생산 DNA의 사이 토신 잔류물을 deaminates 활성화 유발 cytidine의 deaminase (AID)에 의해 시작됩니다. 이러한 uracils 결국 돌연변이와 재조합 1-3 이어지는, 복구 경로의 오류가 발생하기 쉬운 형태로 처리됩니다.

SHM와 CSR의 분자 자세한 내용은 우리의 현재 이해가 생쥐의 연구 조합에서 온, 기본 셀, 셀 라인, 세포 – F합 실험. 마우스 모델은 많은 수리 요인 (예 : 엉, Msh2, Msh6, Exo1, 그리고 효소 η) 40-10 위해 중요한 역할을 보여주는 유전자 knockouts있는 황금 표준 남아 있습니다. 그러나, 모든 유전자 녹아웃 연구에 대한 의무가 있습니다. 예를 들어, 여러 번 스트랜드 브레이크 수리 단백질의 knockouts는 embryonically 치명거나 B – 세포 개발에 11-14을 손상. 또한, 때로는 SHM 또는 CSR에서 단백질의 특정 기능은 녹아웃으로 인한 더 많은 글로벌 결함에 의해 마스크 수 있습니다. 또한, 마우스의 실험 이후 셀 라인에서 개별 유전자의 표현이 후보 유전자 15-18을 식별하고 특성화하기 위해 점점 더 인기를 첫 번째 단계가되었습니다 변경, 긴 수 있습니다.

라모스는 – constitutively SHM를 겪습 Burkitt의 림프종 세포 라인 – SHM 18-24 공부를하기 위해 인기있는 세포 라인 모델을하고 있습니다. 라모스 세포 중 하나 장점은 그들이 내장된 편리한 준결승있다는 것입니다SHM의 – 양적 측정합니다. 야생 타입 세포들은 돌연변이, IgM 표현을 때려 눕힌 변이의 일부를 데리러으로 IgM을 표현합니다. 따라서, 형광 – 활성 세포 검사 (FACS)의 IgM 손실을 시금 것은 SHM의 수준에 대한 읽기 밖으로 빠르게 제공합니다. SHM보다 양적 측정은 직접 항체 유전자를 시퀀싱하여 얻을 수 있습니다.

라모스의 세포가 transfect하기가 어렵습니다 때문에, 우리는 각각 overexpression 카세트 또는 짧은 머리 핀의 자형으로 RNA (shRNA) 중 하나를 포함하는 retroviral 또는 lentiviral 구조와 세포를 감염 증가 또는 개별 유전자의 표현을 떠난 이후 안정적인 파생 상품을 생산합니다. 여기, 우리가 라모스 세포를 감염 후 SHM에서 특정 유전자 (그림 1)의 역할을 조사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

Protocol

1. 준비 샘플 및 세포 overexpression 또는 shRNA 함유 구성과 retroviral 벡터 pKat2 포장 또는 포장 lentiviral 벡터 pVSV – G, pMDLg / pRRE 및 pRSV – 레브 25.의 DNA (midiprep)의 중간 규모 준비를 수행 각각의 구성 6 μg의 DNA와 pVSV – G, pMDLg / pRRE 각각에 대해 하나 pKat2 4 μg (retroviral 감염의 경우) 또는 1.5 μg의 DNA와 pRSV – 수익 포장 벡터 (lentiviral 감염)을 사용합니다. BOSC 23 미디어를 준비합니다. transfe…

Discussion

마찬가지로 이전에 논의, 항체 다양성을위한 세포주 모델 항체 다변화하는 동안 여러 단계에 영향을 소설 단백질을 식별하는 인기있는 출발점이되고 있습니다. 우리는 여기서 라모스 B – 세포 라인에 노크 다운 또는 overexpress 중 단백질로 바이러스 감염을 사용하는 방법을 제시하고 SHM에 미치는 영향을 검사합니다.

이러한 연구에 대한, 우리는 WT 라모스와 AID 안녕 라…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

pMSCV – AID – I – Thy1.1과 pKat2 벡터는 DG Schatz와 pVSV – G, pRSV – 레브의 종류 선물했고, pMDLg / pRRE 벡터는 BR 컬른에서 어떤 선물했다.

Materials

Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
6-well clear TC-treated plates Corning 3516  
10 mL BD Luer-Loksyringes BD Medical 309604  
24-well clear TC-treated plates Corning 3526  
96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates Corning 3596  
100 mm TC-treated culture dishes Corning 430167  
Acrodisc syringe filters, 0.45 μm Pall Life Sciences 4604  
Agar Teknova A7777  
Agarose GeneMate E-3120-500  
Ampicillin Sigma A0166 100 mg/mL in water
BD FACSCanto II flow cytometer BD Biosciences   or similar
BD Falcon round bottom polystyrene tubes BD Biosciences 352054 for FACS
BOSC 23 cells ATCC CRL-11270  
CO2 incubator capable of 37°C      
DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) Sigma D6429  
FBS (fetal bovine serum) Gemini Bio-Products 100-106  
FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody BioLegend 202503 FITC α-Thy1.1
FuGENE 6 Transfection Reagent Roche 11814443001  
HEPES buffer solution Invitrogen 15630-080  
KAPA HiFi DNA polymerase KAPA Biosystems KK2101  
LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder Difco 240230  
MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock Sigma   shRNA vectors
NCS (newborn calf serum) Gemini Bio-Products 100-504  
PBS (phosphate buffered solution) Invitrogen 70011 diluted to 1x in water
PE α-human IgM antibody BioLegend 314508  
PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) Gemini Bio-Products 400-110  
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma 107689 10 mg/mL in water
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495  
Puromycin Sigma P8833 250 μg/mL in water
QIAquick gel extraction kit QIAGEN 28706  
Ramos (RA 1) cells ATCC CRL-1596  
RPMI-1640 medium Sigma R8758  
SuperScript II Invitrogen 18064-022  
SYBR FAST qPCR kit KAPA Biosystems KK4601  
Taq DNA Polymerase Invitrogen 18038-042  
TOPO TA Cloning kit Invitrogen K4520-01  
TRIzol Invitrogen 15596-026  
Wizard SV Genomic DNA purification system Promega A2361  
X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] Growcells C-5687 40 mg/mL in DMSO

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Diesen Artikel zitieren
Upton, D. C., Unniraman, S. Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes. J. Vis. Exp. (57), e3573, doi:10.3791/3573 (2011).

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