Summary

Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses

Published: March 14, 2012
doi:

Summary

Se describe un método relativamente simple de transretinal electrorretinograma (ERG) para la obtención de grabaciones photoresponses conos y bastones de la retina del ratón intacto. Este enfoque se aprovecha del bloque de la transmisión sináptica de fotorreceptores para aislar sus respuestas de luz y grabar usando electrodos colocados sobre el terreno a través de la aislada plana montada en la retina.

Abstract

Hay dos clases distintas de formación de la imagen-los fotorreceptores de la retina de los vertebrados: los bastones y conos. Los bastones son capaces de detectar fotones individuales de luz, mientras que los conos de funcionar de forma continua en las cambiantes condiciones de luz brillante. La absorción de luz por la A-Rod y específicos de cono pigmentos visuales en los segmentos externos de fotorreceptores desencadena una cascada de fototransducción que finalmente conduce al cierre de los nucleótidos cíclicos-bloqueados los canales de la membrana plasmática y la hiperpolarización de la célula. Este cambio inducido por la luz en la membrana de actuales y potenciales pueden ser registrados como una foto-, ya sea por 1,2 de electrodos de aspiración clásica técnica de grabación o grabaciones transretinal electrorretinograma (ERG) de retinas aisladas con componentes farmacológicamente bloqueados respuesta postsináptica 3-5. Este último método permite drogas accesibles duraderos grabaciones de fotorreceptores de ratón y es particularmente útil para obtener photoresponses estables from los conos de ratones escasos y frágiles. En el caso de los conos, estos experimentos se puede realizar tanto en las condiciones adaptados a la oscuridad y la iluminación intensa siguiente que blanquea prácticamente todos pigmento visual, para supervisar el proceso de recuperación de cono de fotosensibilidad en adaptación a la oscuridad 6,7. En este video, vamos a mostrar cómo llevar a cabo de vara y M / L de cono-impulsadas por las grabaciones de transretinal adaptada a la oscuridad retina del ratón. Grabaciones Rod se llevó a cabo utilizando retina de tipo salvaje (C57BL / 6) ratones. Por simplicidad, las grabaciones de cono se obtendrá a partir modificado genéticamente varilla transducina α-subunidad extractor (Tα – / -) ratones que carecen de barra de señalización 8.

Protocol

1. Haciendo electrodos Preparar electrodos de vidrio. Pesar 120 mg de agar y se mezcla en 10 ml de agua destilada (concentración final de 1,2% de agar). Derretir la solución de agar en un baño de agua caliente. Llenar capilares de vidrio (que se usen instrumentos de Word Presision TW100-4 capilares con las siguientes dimensiones: longitud = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, y el volumen interno = 44 l) con la solución de agar con una jeringa de plástico. Solidificar el agar a temperatura ambiente durante 10 m…

Discussion

El método de los bastones, los conos y las grabaciones basadas en transretinal-ERG se ha descrito anteriormente se está convirtiendo en una poderosa herramienta para la investigación de la función de los fotorreceptores de ratón en el tipo salvaje y animales modificados genéticamente. Además de la caracterización de las propiedades de fácil fotorrespuesta básicos, esta técnica simple proporciona estabilidad durante gran respuesta de larga duración experimentos realizados en preparaciones retina cercana al in…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Con el apoyo de premio a la Trayectoria para el Desarrollo de la Investigación y Prevención de la Ceguera, las subvenciones del NIH EY19312 y EY19543 (VJK), así como por la subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera y la EY02687 (Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de la Universidad de Washington).

Materials

Material Name Typ Company Catalogue Number Comment
DL-AP-4   TOCRIS bioscience 0101  
All other reagents   Sigma-Aldrich    
Glass capillaries   World Precision Instruments TW100-4 For making electrodes
Filter paper HARG Millipore HABG01300  
Photometer   UDT Instruments S350 For light calibration
Radiometric silicon sensor   UDT Instruments 221 For light calibration
Anti-vibration table   Technical Manufacturing Corporation TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 To minimize mechanical noise
Air compressor Panther P 15TC   Werther International P 15TC Connected to anti-vibration table
Stereomicroscope   LEICA MZ9.5 For mouse eye dissection
Infrared image converters   B.E.Meyers ProwlerTM Bound to stereomicroscope
Differential amplifier
DP-311
  Warner Instruments DP-311  
Axon Digidata 1440A Digitizer   Molecular Devices 1440A  
Dual Channel 8-pole Filter   KROHN-HITE Corporation 3382  
Ceramic resistor   TE Connectivity CGS SBCHE618RJ For reheating the perfusion solution
Thermocouple T Physitemp Instruments IT-18  
Temperature monitor   Omega DPi32 Connected to thermocouple
LED 505 nm   TT Electronics/ Optek Technology Digi-key P/N 365-1185-ND To apply test flashes/bleaching light
Cautery pen   Bovie AA25 For marking the dorsal part of the mouse eyeball
pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software   Molecular Devices    

Referenzen

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Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses. J. Vis. Exp. (61), e3424, doi:10.3791/3424 (2012).

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