MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

LentiPlex Pooled Ekranı Ilgi shRNA dizileri tanımlamak için, bu hücrelerin büyük çoğunluğu sadece bir shRNA inşa aldığınız ekran kurmak için kritik öneme sahiptir. (Enfeksiyon çokluğu) İçişleri Bakanlığı düşük kullanarak, hücre başına birden fazla integrants olasılığı büyük ölçüde azalır. Ancak, transdüksiyon verimliliği ve bu nedenle istenilen Mois, hedef hücre tipine çok bağlıdır. Bu nedenle, optimal İçişleri Bakanlığı belirlenmesi, yeni bir hücre tipi ekran başlamadan önce gerçekleştirilen olduğunu zorunludur. 1. Misyon LentiPlex hedef hücrelerin İletimi shRNA Kütüphane Pooled Farklı hücre tipleri için kullanılan İçişleri Bakanlığı gerçek değişecektir. Istenen çoğaltır Eğer plaka sayısı buna göre artmış olmalıdır. Buna ek olarak, genellikle farklı alt havuzlar birleştirmek için avantajlı olmaz. Alt havuzlar ayrı tutulması deconvolution sürecinde yardımcı olacaktır. Prope oluntransdüksiyon sırasında uygulanan alt havuzudur numarası ile her doku kültürü çanak r etiketleme. İçişleri düşük bir hücre başına birden fazla integrants olasılığını azaltmak için tavsiye edilir. 1. Gün – 60 mm yemeklerin ertesi gün (toplam = 30 yemekler toplam üç nüsha olarak yapılan her 10 havuzları,) ~ 70% confluency elde etmek için yeterli hücreleri ile Tohum uygun sayıda. Çalışma için, 60 mm yemekleri önce transdüksiyon% 70 confluency ulaşmak için 6 x 105 A549 hücreleri ile ekilirler. Bu hücreleri hala üstel büyüme aşamasında olmasını sağlar. Büyüme oranları hücre tipine göre değişir ve ekran başlamadan önce tespit edilmelidir. Hücreler 37 geceleme kuluçka ° C,% 5 CO 2 atmosferinde nemlendirilmiş bir inkübatör uyması izin verin . (Opsiyonel), negatif kontrol shRNAs transdüksiyon için iki ek 60 mm yemekler ekleyin. Bulaşıkları Label "Kontrol" SHC001H ve "Denetim B" SHC002H için. 2. Gün – Transduce inciLentiPlex viral parçacıkları ile e hücreleri. Iletimi gününde, buz lentiviral parçacıkları çözdürün. Laminer akış kaputu çözülmüş parçacıkları aktarın ve kullanıldıktan hemen değilse buz üzerinde tutmak. Hesaplayın ne kadar, tüm hücre kültürü yemekleri arasında İçişleri Bakanlığı 1 hücrelere eklemek için her bir viral alt havuzu. Örnek: 1 x 10 6 hücre / çanak, Viral titresi = 5 x 10 8 TU / ml; istenen İçişleri Bakanlığı 1. i.) 1 x 10 6 hücre / çanak x (İçişleri Bakanlığı 1) = 1 x 10 6 transducing birimi (TU) gerekli ii) 1 x 10 6 TU / (5.0 x 10 8 C elde TU / ml) lentiviral stok solüsyonu A = 2 mcL uygun çanak eklenmelidir. Hücre kültürü çanak virüsün daha iyi dağılımını sağlamak amacıyla tam bir medya 100-300 mcL virüs hesaplanan miktar seyreltilir. Öncesi numaralı seribaşı hücreleri medya çıkarın. Eksiksiz bir medya contaHer çanak ining hexadimethrine bromür çözüm. Medya hexadimethrine bromür önerilen nihai konsantrasyonu 8 mg / ml. Eğer hedef hücrelerine toksik bulursanız hexadimethrine bromür daha az kullanın. Önceden belirlenmiş bir deney tasarımı uyarınca uygun yemekleri shRNA lentiviral parçacıkları ekleyin. Yavaşça girdap plakalar eşit hücreler boyunca virüs dağıtmak için. 37 az 18-20 saat inkübe ° C,% 5 CO2 bir atmosfer nemlendirilmiş bir inkübatör . (Opsiyonel) A ve Kontrol Bulaşık B. SHC002H (shRNA kontrolü şifreli) aynı deney boyunca deneysel yemekleri bu yemekleri davranın Kontrol Bulaşık (boş vektör shRNA Kontrolü) SHC001H ile İçişleri Bakanlığı aynı tekrarlayın 3-8. 3. Gün – medya değiştirin. Aspire virüs içeren medya ve taze eksiksiz bir medya (hexadimethrine bromür olmadan) ekleyin. ° C gecede 37 hücreleri inkübe edin. 2. Kaplama davranınterapötik bileşen / reaktif hücreler 4. Gün – kuyulardan aspire medya ve optimum konsantrasyonda tedavi bileşeni içeren taze medya ekleyebilirsiniz. Kültür koşullarında olduğu gibi, tedavi değişecektir ve uygun konsantrasyonları ve süreleri önceden tespit edilmelidir. Bizim çalışmamızda, TRAIL ve 1 mcM Paklitakselin 100 ng / ml kullanılır. Hücreler 48 saat süreyle tedavi edildi. T75 şişeler içine Surviving hücreleri yeniden numaralı seribaşı ve neredeyse% 100 konfluent kadar genişletmek için izin olmalıdır. (İsteğe bağlı) seçim sonunda, A ve Kontrol Bulaşık B. Bulaşık A ve B Bulaşık her toplanmış kütüphane yemekleri en az biri daha az koloniler olmalıdır Bulaşık Kontrol inceleyin. Bulaşık koloniler beklenmedik şekilde yüksek bir sayı varsa, ya transdüksiyon süreci istenilen fenotip veya seçici basınç ile ilgili bir yol etkiledi daha testinin yeterince güçlü ve yeniden optimizasyon gerekli olabilir. Bulaşık B, pek çok koloniler içeriyorsaRNAi yolun shRNA ve nişan ifade ilgi fenotipi üzerinde güçlü bir etkiye sahip olabilir. Bu etkisi SHC002H özgü olmadığından emin olmak için SHC001H durumda tekrar. 3. Poliklonal bir hücre popülasyonu gelen deconvolution Her bir alt havuzudur hücreleri heterojen nüfus Hasat ve genomik DNA izole. Çalışmada, hücreler PBS içinde kısaca yıkanmış ve GenElute Memeli Genomik Miniprep kiti ve temin protokolü (Sigma-Aldrich, G1N70) kullanılarak genomik DNA izole önce tripsinize. Alternatif olarak, şu anda piyasada bulunan herhangi bir diğer genomik arıtma kitleri DNA izolasyonu için kullanılabilir. Kültür hücrelerinin başlangıç ​​değeri için protokol tavsiyelerini takip etmek önemlidir. PCR hedefleri. ShRNA şablonu kurtarma yordamı shRNA ekler seçilen hücre popülasyonu tüm havuzun amplifikasyon, ya da vermemek alınmasını sağlartek tek aldı ve genişletildi koloniler çift shRNA şablonları. ShRNA kontrolü ve seçilen hedef hücreleri ekler amplifikasyon sonra, PCR ürünleri sıralı olabilir. Bu PCR adım Sigma Readymix, Katalog No P2893 kullanılarak optimize edilmiştir. Diğer reaktifler amplifikasyonu için kullanılan, ancak bisiklet koşullar ve / veya magnezyum konsantrasyonu başarılı amplifikasyon için modifiye edilmesi gerekebilir. Konsantrasyonu 20 mM Amplifikasyon primerler LentiPlex kiti ile yer almaktadır. Tablo 1'de açıklandığı gibi PCR ayarlayın. Listelenen sırada bileşenleri ekleyin. Açıklanan tutarlar 50 mcL reaksiyon için. Daha fazla reaksiyonlar için istenen reaksiyonlar sayısına göre master miks bileşenleri ölçekli ve% 10 tutarı düşmek. Tavsiye DNA örneğinin miktarı 50-100 ng. Bu güçlü bir reaksiyon için şablon appropr seyreltilmiş MİSYON shRNA İnsan Pozitif Kontrol Vektör oluşur tavsiye edilirkonsantrasyon iate. Bu şablonu ile başarılı amplifikasyon PCR bileşenleri ve bisiklet koşulları yeterli olduğunu gösterir. NOT: deneysel numuneler ve reaktifler kontaminasyon önlemek için, pozitif kontrol sonraki PCR reaksiyonları yerden ayrı bir yerde seyreltilmiş olması tavsiye edilir. PCR içine Tablo 2'de listelenen PCR programı kaydedin. Her bir örnek için, DirectLoad 5 mcL yanında boya ve electrophorese 1 mcL ile 3 mcL PCR ™ PCR 100 baz puan (bp) Düşük Merdiven, Katalog Numarası D3687% 1 agaroz jel üzerinde 309 bp Amplikon varlığını doğrulamak için birleştirir. PCR amplikonlarının Subcloning: PCR ürünleri TOPO (Invitrogen, K4575-01), üretici protokolü takip TOPO-TA klonlama kiti kullanarak klonlanmış. Sonuç, bir PCR ürünü her vektör bulunan olmasıdır. 250 Bireysel bakteri kolonileri izole (her bir birey PCR Amplikon içeren) ve büyümeye edildin, 100 mg / ml ampisilin ile 2 ml LB kültürlerde. Plazmid DNA GenElute Plazmid Miniprep kiti (Sigma-Aldrich, PLN70) kullanılarak elde edildi. Saf EcoRI plazmid DNA ile sindirilir ve eklemek varlığını doğrulamak için electrophoresed. Plazmid DNA örnekleri daha sonra sıralı ve shRNA eklemek LentiPlex kütüphanesi ile sağlanan LentiPlex shRNA Sıra Ara veritabanı kullanılarak belirlendi. 4. Hedef Belirleme ve Doğrulama ShRNA GAAACACCGG-5'-3 'dizisini başlatır. Arama kutusuna sorgu sırası kapalı shRNA Sıra Arama Access veritabanı form üzerinde en az 10 Bundan sonraki ama en az 21 nükleotidler girin. Toplanmış shRNA türler seçin. İsteğe bağlı olarak, alt havuzudur dizisi bulundu seçin. Şimdi arama yapmak için "Potansiyel Hitler Bul" butonuna tıklayın. Bu th eşleşen ilgili TRC shRNA dizi (ler) tanımlamak gerekire veri sıralama. TRC shRNA dizisi hakkında daha fazla bilgi (ler) inin ve ilgili gen hedefleri Sigma-Aldrich En Gen kolayca bulunabilir: http://www.sigma.com/yfg Belirlenen hedef genler orijinal TRC klon artı 1 shRNA 1 kuyusunda formatında kullanarak aynı genin hedef en az iki ek shRNAs orijinal tarama testinin tekrar valide edilmelidir. Gerçek tıklama kuyuların çoğunda aynı fenotipi gösterecektir. 5. Temsilcisi Sonuçlar LentiPlex toplanmış ekran iş akışı bir örnek Şekil 1'de ayrıntılı olarak verilmiştir. TRAIL ve Paklitakselin huzurunda çoğaldı ki Transduced hücreleri şişeler konfluent kadar genişletmek için izin verildi. Genomik DNA hasat ve PCR ve klonlama tabi Şekil 1'de gösterildiği gibi, sıralama ve shRNA kimlik sunulmadan önce figu açıklananre 1 C. 250 klonları bu 25, sıralı birden fazla klonları tarafından temsil edildi ve geri kalan 225 sadece 1 klon tarafından temsil edildi ve şu anda takip değildi. Şekil 2'de görüldüğü gibi, TBX3, PPP2CA ve AKT2 dahil olmak üzere birçok aday genler birden fazla klonları tarafından temsil edilmiştir. T-box transkripsiyon faktörü, TBX3 toplam dört klonların ortaya çıktı ve 5 tümör göç suçlanmıştır. PPP2CA baskılanması androjen yoksunluğu ile indüklenen hücre döngüsü tutuklama giderici ve 6 apoptozis önlenmesi androjen eksikliği koşullarında kültür LNCaP hücrelerinin büyümesini sürdürmek için kanıtlanmıştır. AKT2 kanser gelişimi 7, 8 birkaç rol oynadığı gösterilmiştir RAC-beta serin / treonin protein kinaz ve varsayılan onkogen. * Final konsantrasyon Mg 2 + çözümü 3 mM olacak;Taq Readymix ve Magnezyum klorür solüsyonu 1.5 mM 1.5 mM katkıda bulunulmuştur. (Tablo 1). Lentiplex PCR Reaksiyon Koşullar (Tablo 2). Lentiplex PCR Amplifikasyon Programı Şekil 1. (A) LentiPlex, ekran havuzlu (B) Poliklonal deconvolution iş akışı, (C) ve shRNA hedeflerin belirlenmesi. A. LentiPlex ekran toplanmış, Tohum hücreleri, daha sonra (toplam 10 havuzları, her üç nüsha olarak yapılan, toplam 30 yemekleri için), shRNA alt havuzlar ekleyin. Sonra, tedavi bileşen / reaktif (bizim durumumuzda, TRAIL ve Pa ile tedavisırasıyla clitaxel). Sonra hayatta kalan hücreler, matara kalkarlar ve genişletilmesine izin verir. Hasat her bir alt havuzudur hücreleri heterojen nüfus ve genomik DNA izole. B. Poliklonal deconvolution. ShRNA eklemek içeren DNA yükseltmek için PCR gerçekleştirin. Şablon gDNA da poliklonal beri PCR ürününün boyutu, üniforma, ama sırayla poliklonal. PCR ürünü vektör klonlanmış ve daha sonra yetkili bakteri dönüştü. C. shRNA hedeflerin belirlenmesi. Bireysel koloniler izole edilir ve plazmid DNA elde edilir. Her klon, tek PCR parçası ile klonlama vektörü içerir. Plazmid DNA ekleme ve sıralı varlığını doğrulamak için sindirilir. ShRNA eklemek LentiPlex shRNA Sıra Ara veritabanı kullanılarak belirlendi. Şekil 2. Can Belirlenendidate Genler 25 aday genler birden fazla isabet ettiğini tespit edildi. 225 aday genler sadece 1 isabet etti ve takip değildi. Ek Tablo 1 aday gen tek başına klonların bir arıza için bakınız. Ek Tablo 1. Bireysel TRC Kütüphane klonlar Poliklonal Sıralama Gen ID itibaren Belirlenen Algılandı Klonlar Hits