LentiPlex MISSÃO Pooled shRNA Screening Biblioteca em células de mamíferos

LentiPlex Configuração da Tela de Pooled Para identificar seqüências shRNA de interesse, é fundamental para configurar a tela de tal forma que a maioria das células recebem apenas um shRNA construir. Usando uma baixa MOI (multiplicidade de infecção), a probabilidade de vários integrantes por célula é diminuído substancialmente. No entanto, a eficiência de transdução, e, portanto, MOIS desejado, depende fortemente do tipo de célula-alvo. Portanto, é imperativo que a determinação do MOI ideal é realizado antes de iniciar a tela em um novo tipo de célula. 1. Transdução de células alvo com o LentiPlex Missão Pooled shRNA Biblioteca O real MOI utilizado irá variar para diferentes tipos de células. Se replica são desejados, em seguida, o número de placas deve ser aumentado em conformidade. Além disso, normalmente, não será vantajoso para combinar a subpools diferentes. Mantendo o subpools separado auxiliar no processo de deconvolução. Garantir Proper rotulagem de cada prato de cultura de tecidos com o número subpool que é aplicada durante a transdução. A baixa MOI é aconselhado a reduzir a probabilidade de vários integrantes por célula. Dia 1 – Semente do número apropriado de 60 mm de pratos com células suficientes para obter ~ 70% confluência no dia seguinte (10 piscinas no total, cada um realizado em triplicata = 30 pratos total). Para o nosso estudo, 60 pratos mm foram semeados com 6 x 105 células A549 para alcançar uma confluência de 70% antes de transdução. Isso garante que as células ainda estão em fase de crescimento exponencial. Taxas de crescimento variam de acordo com tipo de célula e deve ser determinado antes de iniciar a tela. Permitem que as células a aderir pela incubação overnight a 37 ° C em uma incubadora umidificada em uma atmosfera de 5% CO 2. (Opcional) Incluir mais dois pratos de 60 mm para a transdução com shRNAs controle negativo. Rotular os pratos "Controle A" para SHC001H e "Control B" para SHC002H. Dia 2 – ª transduçãocélulas e com as partículas LentiPlex viral. No dia da transdução, descongelar as partículas lentiviral no gelo. Transferir as partículas descongelado para uma capela de fluxo laminar e manter em gelo, se não ser utilizado imediatamente. Calcular o quanto de cada indivíduo viral sub-pool para adicionar as células para obter o MOI de 1 em todas as placas de cultura de célula. Exemplo: 1 x 10 6 células / prato; título Viral = 5 x 10 8 TU / ml, um desejado MOI de 1. i.) 1 x 10 6 células / prato x (MOI de 1) = 1 x 10 6 unidades de transdução (TU) necessários ii.) 1 x 10 6 TU / (5,0 x 10 8 TU / ml) obtidos a partir do C da A = 2 mL da solução de reserva lentiviral deve ser adicionado ao prato apropriado. Diluir o montante calculado do vírus em 100-300 mL de mídia completa, a fim de assegurar uma melhor distribuição do vírus quando adicionado ao prato de cultura de células. Remova a mídia a partir de células pré-semeado. Adicionar completa media Contasolução de brometo Ining Hexadimetrina para cada prato. A concentração final recomendada de brometo de Hexadimetrina nos meios de comunicação é de 8 mg / ml. Use menos o brometo Hexadimetrina se você achar que ele seja tóxico para as células-alvo. Adicionar Particulas de Lentivirus shRNA aos pratos apropriados, em conformidade com o projeto pré-determinado experimental. Agite suavemente as placas para distribuir uniformemente o vírus através de células. Incubar 18-20 horas a 37 ° C em uma incubadora umidificada em uma atmosfera de 5% CO 2. (Opcional) Repita 3-8 na idênticos MOI com SHC001H (vazio vetor shRNA Control) em Dish Controle A e SHC002H (mexidos shRNA controle) em Dish Controle B. Tratar estes pratos de forma idêntica para os pratos experimentais durante o experimento. Dia 3 – Troque a mídia. Aspirar-vírus contendo mídia e adicionar novos media completo (sem brometo de Hexadimetrina). Incubar as células a 37 ° C durante a noite. 2. Tratar platedcélulas com componente terapêutica / reagente Dia 4 – Aspirar media de poços e adicionar novas mídias contendo componente terapêutica na concentração ideal. Tal como acontece com as condições de cultura, os tratamentos vão variar e concentrações adequadas e durações deve ser determinada de antemão. Em nosso estudo, foram utilizados 100 ng / mL de TRAIL e 1 mM de Paclitaxel. Células foram tratadas por 48 horas. Células sobreviventes devem ser re-semeada em frascos T75 e permitiu expandir até quase 100% confluentes. (Opcional) No final da seleção, inspecionar controle Dish A e Controle Dish Dish B. A e B Dish cada um deve ter menos de colônias, pelo menos, um dos pratos biblioteca pool. Se houver um número inesperadamente elevado de colônias em um prato, que qualquer processo de transdução afetou um caminho relacionado com o fenótipo desejado ou a pressão seletiva não é suficientemente forte e re-otimização do ensaio pode ser necessária. Se B Dish contém muitas colônias, Então a expressão de shRNA eo engajamento da via RNAi pode ter um efeito sobre o fenótipo de interesse. Se este for o caso repita com SHC001H, para garantir que o efeito não é específico para SHC002H. 3. Deconvolução a partir de uma população de células policlonais Colheita da população heterogênea de células de cada subconjunto e isolar DNA genômico. Em nosso estudo, as células foram lavadas rapidamente em PBS e tripsinizados antes de DNA genômico foi isolado usando o GenElute mamíferos Genomic Miniprep kit e fornecido protocolo (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternativamente, qualquer kits de purificação de genômica outros que estão atualmente disponíveis no mercado podem ser usados ​​para o isolamento de DNA. É importante seguir as recomendações de protocolo para o montante de partida das células em cultura. A amplificação de alvos. O procedimento de recuperação shRNA modelo permite a amplificação de todo o pool de inserções shRNA da população de células selecionado, ou a recuperação de individupla modelos shRNA de colônias que foram escolhidos individualmente e expandido. Após a amplificação de insertos shRNA do controle e as células-alvo selecionados, os produtos de PCR pode ser seqüenciado. Esta etapa de amplificação por PCR foi otimizada utilizando Sigma Readymix, Catalog No. P2893. Outros reagentes podem ser usados ​​para a amplificação, mas as condições de bicicleta e / ou concentração de magnésio pode precisar ser modificado para amplificação bem sucedida. Primers de amplificação na concentração de 20 mM estão incluídos no kit LentiPlex. Configurar a reação de PCR, conforme descrito na Tabela 1. Adicione os componentes na ordem listada. Os montantes descritos são para uma reação de 50 mL. Para mais reacções, escala os componentes master mix pelo número desejado de reações e incluem sobrecarga de 10%. A quantidade de DNA modelo recomendado é de 50-100 ng. É altamente recomendável que, para uma reação do modelo consiste na MISSÃO Controle de Vetores shRNA Humanos Positivo diluído para o adequado doiate de concentração. Amplificação de sucesso com este modelo indica que os componentes ensaio de PCR e as condições de ciclismo são adequados. NOTA: Para evitar contaminações de amostras e reagentes experimental, sugere-se que o controlo positivo seja diluído em um local separado, onde as reações posteriores PCR são criados. Salve o programa PCR listados na Tabela 2 em seu termociclador. Para cada amostra, combine 3 mL de reação de PCR com 1 mL de corante e electroforese juntamente com 5 mL de DirectLoad ™ PCR 100 bp Escada Baixo, número de catálogo D3687 em um gel de agarose 1% para confirmar a presença de um amplicon bp 309. Subclonagem de PCR amplicons: produtos de PCR foram clonados TOPO utilizando o kit de clonagem TOPO-TA, seguindo o protocolo do fabricante (Invitrogen, K4575-01). O resultado é que um produto de PCR está contido em cada vetor. 250 colônias de bactérias individuais (cada um contendo um indivíduo amplicon PCR) foram isolados e crescern em 2 mL de culturas LB com 100 mg / mL ampicilina. DNA plasmidial foi então extraído usando o GenElute Plasmid Miniprep kit (Sigma-Aldrich, PLN70). DNA plasmidial purificado foi digerido com EcoRI e eletroforese para confirmar a presença do inserto. Amostras de DNA plasmidial foram seqüenciados ea inserção shRNA identificados utilizando o banco de dados LentiPlex shRNA Pesquisa Sequence fornecido com a biblioteca LentiPlex. 4. Identificação e Validação alvo A seqüência inicia com shRNA 5'-GAAACACCGG-3 '. Digite pelo menos nos próximos 10, mas menos de 21 nucleotídeos como a seqüência de consulta na caixa de pesquisa na sequência shRNA fechado Pesquisa forma banco de dados Access. Selecionar as espécies do shRNA em pool. Opcionalmente, selecione o subconjunto a partir do qual a seqüência foi encontrado. Agora clique em "Find hits em potencial" para realizar a pesquisa. Isto deve identificar o correspondente TRC seqüência shRNA (s) que correspondem ªe seqüenciamento de dados. Mais informações sobre a seqüência shRNA TRC (s) identificados e as metas gene correspondente pode ser facilmente encontrada no Sigma-Aldrich é o seu favorito Gene: http://www.sigma.com/yfg Genes-alvo identificados devem ser validados pela repetição do ensaio de rastreio original com o clone TRC original mais pelo menos duas shRNAs adicionais que visam o mesmo gene usando um shRNA 1-1 formato bem. Bate verdade irá exibir o mesmo fenótipo na maioria dos poços. 5. Resultados representante Um exemplo de um fluxo de trabalho da tela LentiPlex pooled é detalhado na Figura 1. Transduzidas células que proliferaram na presença de TRAIL e Paclitaxel foram autorizados a se expandir até frascos foram confluentes. DNA genômico foi colhida e submetida à amplificação por PCR e clonagem como ilustrado na Figura 1 A, antes de ser submetido à identificação e seqüenciamento shRNA como descrito no FIGUre 1 C. 250 clones foram seqüenciados, destes 25 foram representados por clones múltiplos e os 225 restantes foram representados por apenas um clone e não foram perseguidos neste momento. Conforme mostrado na Figura 2, vários genes candidatos, incluindo TBX3, PPP2CA e AKT2 foram representados por clones múltiplos. O fator de transcrição T-box, TBX3 apareceu em um total de quatro clones e tem sido implicado na migração do tumor 5. Downregulation PPP2CA tem sido demonstrado para manter o crescimento de células cultivadas em LNCaP andrógeno condições deficientes, aliviando o andrógeno-privação induzida por parada do ciclo celular e impedindo a apoptose 6. AKT2 é uma serina RAC-beta / treonina proteína-quinase e oncogene putativo demonstrado que desempenhar vários papéis em câncer de desenvolvimento 7, 8. * Concentração final de Mg 2 + em solução será de 3 mM;1,5 mM é uma contribuição do Readymix Taq e 1,5 mM de solução de cloreto de magnésio. Tabela 1. Reaction Lentiplex Condições PCR Tabela 2. Lentiplex Programa de Amplificação PCR Figura 1. (A) LentiPlex pooled tela, (B) deconvolução workflow policlonais, e (C) identificação de alvos shRNA. LentiPlex A. pooled tela. Primeiro, as células de sementes, em seguida, adicione subpools shRNA, (10 piscinas no total, cada uma feita em triplicado, por 30 pratos total). Em seguida, tratar com componente terapêutica / reagente (no nosso caso, TRAIL e Paclitaxel, respectivamente). Então, reseed células sobreviventes em frascos e deixe crescer. População heterogênea colheita de células de cada subconjunto e isolar DNA genômico. B. deconvolução policlonais. Perform PCR para amplificar DNA contendo a inserção shRNA. O produto da PCR é uniforme em tamanho, mas policlonais em seqüência desde o gDNA modelo também foi policlonais. Produto de PCR é clonado no vetor e depois transformado em bactérias competentes. C. Identificação de alvos shRNA. Colônias individuais são isolados e plasmídeo de DNA é extraído. Cada clone contém o vetor de clonagem com um fragmento de PCR individual. Plasmídeo de DNA é digerido para confirmar a presença da inserção e seqüenciados. A inserção shRNA é identificado usando o banco de dados LentiPlex shRNA Pesquisa Sequence. Figura 2. Pode identificadosGenes didatos. 25 genes candidatos foram identificados, que tinha vários hits. 225 genes candidatos tiveram apenas 1 hit e não foram perseguidos. Por favor, consulte a Tabela Complementar 1 para a repartição dos clones individuais por gene candidato. Tabela Suplementar 1. Clones individuais TRC Biblioteca identificados a partir de ID policlonais Seqüenciamento Gene hits Clones detectado.