Summary

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

Published: October 07, 2011
doi:

Summary

Bu makale, embriyonik deri ve timüs kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

Fonksiyonel bir damar ağının kurulması organogenez önemli bir parçası olduğunu ve optimal organ fonksiyonları için gereklidir. Örneğin, timüs uygun damar oluşumu ve dokusunda organ ve çevre için olgun T-hücresi çıkışında içine timosit giriş için gereklidir. Timus kan damarlarının mekansal düzenleme yerel mikroçevrede, yani timik epitel hücreleri (TEC) gelen sinyalleri bağlıdır. Birkaç yeni raporlar timus damar kusurları 1,2 bu sinyallerin sonuçları bu bozulma göstermektedir. Önceki çalışmalarda yenidoğan ve yetişkin timus damar 1,2 etiketlemek için kullanılan teknikler tarif var. Biz burada embriyonik timus kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir tekniği göstermek. Yüz damar enjeksiyonu ve CD31 antikor boyama timüs va tespit etmek – bu yöntem simplicifolia lektin I (isolectin B 4 GSL 1) FITC-dekstran ya da Griffonia (Bandeiraea) kullanılması birleştirirscular yapıları ve PDGFR-β timik perivasküler mezenşimi 3-5 etiketlemek için. Cryosections veya vibratome bölümleri kullanma seçeneği de sağlanır. Bu protokol, timüs kan damarı oluşumuna TEC-türetilen molekülleri rollerin tanımlanması için kritik olan timus damar bozuklukları, belirlemek için kullanılabilir. Yöntemi, tüm damar etiket olarak, aynı zamanda deri ve kalp 6-10 içeren embriyo boyunca birden fazla organ ve dokularda damar ağları analiz etmek için de kullanılabilir.

Protocol

1. Flöresein dekstran ve GSL I-isolectin B 4 yüz ven enjeksiyonlar embriyonik damar etiketlemek için etiketlenmiş Fosfat içinde FITC-dekstran (50ug/mL) hazırlayın Tamponlu Tuz (PBS) veya GSL 1 – isolectin B, bir 1,5 mL Eppendorf tüpü içinde PBS içinde 4 (20ug/200uL) ve 37 ° C'de sıcak Yeşil / PBS GSL 1. Yeşil / PBS FITC-Dekstran solüsyonunun (toplam hacmi 1 ml) ve stok 1.25mm Fast 180uL stok 1.25mm Fast 100ul Ekle – isolectin çözümdür böylece B 4 (topl…

Discussion

Bölümlerde Tüm-mount ve PECAM-1 (CD31) boyama embriyonik farelerde damar etiketleme için geleneksel yöntemler vardır. Bu yöntemler doğrudan ve / veya dolaylı immunfloresan ve deterjan kullanımı fare doku geçirgenliği gerektirir. Bu oldukça zamanında süreç olduğunu kanıtlıyor. Burada, FITC-dekstran ya isolectin B 4 yüz damar enjeksiyonu doğrudan böylece antikor etiketleme adımlar için ihtiyacı ortadan kaldırarak, embriyonik damar etiketlemek için istihdam var. 'Sızdıran' f…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser hibe numaraları R01AI055001 ve NIAID gelen UYM ve JLB için SREB Tezi Bursu Ödülü R01AI082127 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
FITC-dextran Sigma FD150S-1G
Fluorescein labeled GSL 1 – isolectin B4 Vector Laboratories FL-1201
Fast Green MP Biomedicals 195178
PFA Fluka 76240
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. VWR 25608-930
Acetone JT Baker 9006-33
Donkey Serum Jackson 017-000-121
rat anti-mouse CD31, BD Pharmingen 558736
goat anti-mouse PDGFR-β R&D Systems AF1042
donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) Biolegend 102516
donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) Invitrogen A11058
Triton X -100 Sigma-Aldrich X-100
Low melt agarose/PBS Sigma-Aldrich A9414-25G
Methanol Fisher Scientific A413-4
Benzyl Alcohol Acros Scientific 148390010
Benzyl Benzoate Acros Scientific 105860010
Depression slides Fisher Scientific S175201
Fluorogel Electron Microscopy Sciences 17985-10
Cover Glass (22X22)-1.5 Thermo Scientific 152222
Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope Zeiss  
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135
Parafilm No. OM992 Fisher Scientific 13-374-16
12 and 24 well microplates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Superfrost/Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
4mL clear vials National Scientific B7800-2

Referenzen

  1. Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
  2. Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
  3. Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
  4. Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
  5. Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
  6. Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
  7. Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
  8. Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
  9. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  10. Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Bryson, J. L., Coles, M. C., Manley, N. R. A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice. J. Vis. Exp. (56), e3267, doi:10.3791/3267 (2011).

View Video