De corte de carga: una herramienta útil para examinar el grado de acoplamiento Marcador brecha unión entre las neuronas retinianas

1. Intactos los preparativos retina neural de peces de colores, ratones y conejos Realizar todos los pasos siguientes, incluyendo los descritos en "2) Corte de carga", en constante ambiental (de fondo) la iluminación. Tenga en cuenta que a los efectos de este protocolo, los procedimientos se describen como se realiza en la oscuridad constante (es decir, en condiciones muy oscuras (es decir, "escotópica") las condiciones ≤ 0,0001 lux) con gafas de visión nocturna por infrarrojos, pero otros niveles más altos de intensidad de la iluminación ambiente constante puede utilizarse en lugar de determinar el efecto de otros niveles de iluminación ambiental en el cruce de acoplamiento brecha marcador. Dark-adaptación de los animales de experimentación (peces de colores, ratón o conejo) por lo menos 1 hora antes de la cirugía. Como se ha descrito anteriormente, 7, profundamente anestesiar peces de colores, colocándolas en tricaína metanosulfonato (MS222, 150 mg / L de agua tamponada (bicarbonato de sodio que contienen) pecera), y profundamente anestesiar a ratones con ketamina (100 mg/ Kg, ip) y Rompun (10 mg / kg, ip). Profundamente anestesiar a los conejos con uretano (dosis de carga: 2,0 g / kg, ip) y también el uso de anestesia local intraorbitario (2% de xilocaína), como se describió previamente 8. Todos los procedimientos experimentales relacionados con el cuidado y uso de animales debe realizarse de acuerdo con las normas federales y ser revisados ​​y aprobados por el cuidado de animales locales y los comités de la universidad el uso. (Nota:. En los experimentos descritos aquí, todos los procedimientos experimentales relacionados con el cuidado y el uso de peces, ratones y conejos fueron realizados de acuerdo con las directrices de NIH y fueron revisados ​​y aprobados por la Ohio State Cuidado de Animales Institucional de la Universidad y el empleo) Para los peces, ratones y conejos, después de la enucleación, retire la parte anterior de cada globo ocular. A continuación, coloque un pedazo de papel de filtro en la parte superior de la parte posterior del ojo y se invierte el papel de filtro y el ojo, por lo que el papel de filtro por debajo de la parte posterior del ojo. Luego, utilizando bienpinzas de disección de la retina neural intacto desde la parte posterior del ojo suavemente pelando el epitelio pigmentario / coroides / esclerótica, que se unen el uno al otro, de la retina neural, que se adjunta al papel de filtro. Una vez hecho esto, cortar el nervio óptico con multa de resorte tijeras. La retina neural, orientado a los fotorreceptores del lado de arriba debe ser conectado al papel de filtro y separada del resto del ojo. 2. De corte de carga Sumerja las retinas de solución oxigenada de Ringer (Tabla 1) en una placa de 6 pocillos (~ 5 ml / pocillo) durante 30 minutos bajo constante ambiental (de fondo) iluminación (por ejemplo, en condiciones muy oscuras (es decir, "escotópica") las condiciones) con o sin una prueba de drogas. Mantener las retinas de los peces en el oxigenada (5% de CO 2 / 95% O 2) de bicarbonato de Ringer a 22 ° C mediante el sellado de placa de 6 pocillos con parafilm y mantener las retinas de ratón y conejo a 36 ° C en un 5% de CO 2 / 95% O <sub> 2 incubadora. Cuando una prueba de la droga que se utilice, debe estar presente durante todas las etapas posteriores hasta la fijación Prepare la solución de trazador (típicamente 100 l) por disolución de neurobiotin (0,5%), una molécula de biotina, en solución de Ringer inmediatamente antes de cortar a través de la retina. Tenga en cuenta que el 0,5% rodamina dextrano (alta (> 10.000) MW) se puede añadir a la solución. Debido a su alto peso molecular, rodamina dextrano no cruza uniones y las células sólo etiquetas que han sido dañadas por el corte. Como se muestra en la fig. 3, esta es una manera útil para distinguir las células que se han acumulado neurobiotin porque han sido heridos, de los que han acumulado el marcador por difusión a través de uniones. Ponga la solución neurobiotin en una copa (o plástico) una placa de Petri, toque el papel de filtro, al que se une a la retina, sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de Ringer, baño una hoja de afeitar (o cuchilla afilada de otro tipo) en la solución y neurobiotin lan hacer un corte radial a través de la retina y el papel de filtro. Si se prefiere, se puede utilizar separadores para que el corte se hace a través de la retina, pero no el papel de filtro. El corte debe ser orientado perpendicular a la superficie de la retina. Sumerja la hoja de afeitar en la solución neurobiotin de nuevo y cortar la retina una segunda vez. Repita este hasta 4 cortes por la retina (ver fig. 1). Utilizar un microscopio de disección la hora de hacer cortes de navaja a través del ratón y otros pequeños retinas. Como se muestra en la fig. 1, se sumergen en la retina de nuevo en medio del timbre fresco, con o sin prueba de la droga, con un 6-así placa (5 ml Ringer / pocillo). Incubar la retina durante 15 minutos para permitir la carga y la difusión. Lavar tres veces durante 5 minutos cada uno con medio Ringer fresco con o sin prueba de la droga. Fijar la retina con un 4% de paraformaldehído en 0,1 M de fosfato buffer (PBS, pH 7,4) durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar con PBS 0,1 M durante la noche a 4 ° C. Al día siguiente, reaccionan wITH 2% de estreptavidina-Alexa 488 (concentración final de 10 mg / mL) en 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100, y mantener durante la noche a 4 ° C. Lavar tres veces durante 10 minutos cada uno con 0,1 M de PBS a temperatura ambiente En PBS, desprenderse la retina del papel de filtro y luego, utilizando un pincel fino, el lugar de la retina, los fotorreceptores orientada hacia arriba, en un portaobjetos. Suavemente montaje con Vectashield medio de montaje (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Tomar fotos con un microscopio confocal de barrido láser (por ejemplo, Zeiss 510 META) con el mismo aumento de resolución y ajustes para cada condición experimental, para que pueda comparar los efectos de diferentes condiciones experimentales (por ejemplo, medicamentos de prueba, las condiciones de iluminación) en la medida de brecha de la unión del trazador de acoplamiento (Fig. 2A-C y la fig. 4A-C). Aunque una sola imagen puede contener todas las células marcadas, se recomienda que recoja un z-stack de la zona de interés y el colapso en una solaimagen. 3. La cuantificación del marcador de acoplamiento con ImageJ En el explorador de imágenes LSM, abrir la imagen, haga clic en Exportar y guarde la imagen como un poco TIF-16 NO de archivos comprimidos. Barra de escala deben ser incluidos en esta imagen TIF. Utilizando el software NIH ImageJ, medir la intensidad de fluorescencia de Alexa-488-etiquetados neurobiotin de imágenes de baja magnificación de todo el montaje retinas. Abra el archivo TIF con el software ImageJ y luego dibujar una línea recta que corresponde a la barra de escala. Ir al ANALIZAR, Definición de la escala y entrar en la distancia conocida y unidad de longitud, a continuación, haga clic en Aceptar. Ahora los resultados de medición se pueden presentar en las unidades de calibrado, como milímetros. Seleccione el área de interés utilizando la herramienta de selección rectangular. El pico de la fluorescencia se debe colocar en el borde izquierdo de la selección. Asegúrese de que no hay ninguna señal de fluorescencia cerca del borde derecho. Si no es así, girar la imagen activa (imagen, a continuación, gire). ClicAnalizar y gráfico de perfil. Usted debe ver una curva con un decaimiento exponencial de la izquierda a la derecha. Haga clic en Copiar en la ventana pop-up y pegar en Excel. Ahora se ven dos columnas que muestra la distancia de la corte (columna izquierda) y la intensidad de fluorescencia en función de la distancia de la corte (columna derecha). Divida cada valor de fluorescencia prima por el valor máximo de fluorescencia para obtener la intensidad de fluorescencia relativa. Copiar dos columnas correspondientes a la distancia de la corte (X) y la intensidad de fluorescencia relativa (Y), y luego pegarlos en el software de origen. Encajar con el decaimiento exponencial # 1 función (Fig. 2D y 4D fig.), Que es en la forma: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) donde Y es la intensidad de fluorescencia relativa, Y o es la fluorescencia de fondo, Y max es la fluorescencia relativa máxima, λ es la spas (longitud) constante, y x es la distancia desde el corte. Compare el espacio constante (λ) los valores en diferentes condiciones experimentales utilizando el t-test o ANOVA (Fig. 2E y 4E fig.). Tenga en cuenta que las técnicas alternativas de cuantificación han sido descritas por otros 13,14. 4. Resultados representante Ejemplos representativos de trazador células fotorreceptoras de acoplamiento según lo determinado por el corte de carga se presentan en las figuras 2 y 3 (pescado) y la Figura 4 (conejo). Confocal imágenes fueron tomadas usando los mismos parámetros de comparación (Fig. 2A-C y la fig. 4A-C) y la intensidad de fluorescencia se representa en función de la distancia desde el corte y el montaje de la función exponencial se muestra en el número 3.8 (Fig. 2D y 4D fig.). Espacio de valores constantes para cada condiciónse muestran en las figuras 2E y 4E, lo que demuestra que el grado de unión de acoplamiento brecha trazador puede ser cuantificado mediante la técnica de corte de carga. Además, los resultados son altamente reproducibles. El uso de la técnica de corte de carga como un medio para cuantificar el grado de unión de acoplamiento brecha trazador también se confirma por el hallazgo de que la intensidad de fluorescencia disminuye de forma exponencial en función de la distancia de la corte en todos los casos examinados 7,8 (véase también Figs. 2D y 4D aquí), lo que indica que neurobiotin entró a través de los fotorreceptores de la corte de afeitar y no de otros lugares de la retina. Por otra parte, la cualitativamente similares de día / noche la diferencia en el acoplamiento de los fotorreceptores trazador celular observado en peces de colores con las inyecciones de trazador en los conos individuales y con un corte de carga de 7 corrobora de corte de carga como un medio relativamente precisa de medir el grado de acoplamiento de los fotorreceptores. El corte de loading técnica también se puede utilizar para investigar otros tipos de sinapsis eléctricas en la retina. Por ejemplo, la Figura 5 muestra el conejo de tipo A (Fig. 5) y tipo B (Fig. 5B) las células horizontales muestran homóloga marcador de acoplamiento después de cortar la carga y la difusión de neurobiotin adaptada a la oscuridad bajo condiciones. Compuesto Pescado Ratón Conejo NaCl 130 120 117 NaHCO3 20 25 30 NaH 2 PO 4 – 1 0.5 KCl 2.5 5 3.1 Glucosa 10 10 10 MgCl2 1 – – MgSO 4 7H 2 O – 1 1.2 Glutamina – 0.1 0.1 CaCl2 0.7 2 2 Cuadro 1: Composición de las soluciones de Ringer para peces de colores, el ratón y las retinas de conejo. Las concentraciones se presentan en mM. Soluciones de Ringer se traspasan con CO2 al 5% / 95% O 2 y se mantiene a 22 ° C (de pescado) o 36 ° C (mamíferos). "-" No se incluye en el timbre para esta especie. Figura 1:. Diagrama de flujo que muestra el procedimiento de corte de carga. Tras el aislamiento of de la retina neural intacto, varios cortes radiales fueron hechas por una lámina que se sumerge por primera vez en solución neurobiotin 0,5%. La retina se incubó durante la carga y la difusión del trazador, y luego se lavan antes de la fijación con paraformaldehído al 4% (PFA) en 0,1 M de tampón fosfato (PB). Trazador de acoplamiento fue examinada utilizando estreptavidina conjugada con Alexa-488. Figura 2. Día-noche diferencia en los fotorreceptores de acoplamiento del trazador en peces de colores se revela mediante la técnica de corte de carga. Células fotorreceptoras gap junction neurobiotin marcador de acoplamiento fue extensa en la noche (B) y en el día después de la aplicación de spiperona (10 M), un selectivo de la dopamina D 2 antagonista de los receptores (C), pero no en el día bajo condiciones control (A). D) normalizado intensidad relativa de fluorescencia en función de la distancia de los cortes (indicado por las flechas en AC). E) Espacio valores constantesUES obtenidos a partir de los datos en los experimentos D y otros (n = 4). *** P <0,001. Figura 3. Un ejemplo representativo que muestra la fluorescencia en la capa de células fotorreceptoras de la retina adaptada a la oscuridad peces de colores en la noche después de cortar la carga con una solución de dos neurobiotin y dextrano rodamina. Rodamina dextrano (en rojo), que no se difunde a través de canales abiertos de unión brecha debido a su alto peso molecular (> 10.000 MW), sólo las células marcadas cerca del corte. Por el contrario, neurobiotin (en verde) difundido a través de uniones y se puede ver en las células fotorreceptoras lejos de la corte. La ubicación de la corte es indicado por la flecha en cada panel. Barra de escala: 200 micras. Figura 4. Día-noche diferentecia en los fotorreceptores marcador de acoplamiento en retina de un conejo se revela mediante la técnica de corte de carga. Células fotorreceptoras gap junction neurobiotin marcador de acoplamiento fue extensa en la noche (B) y en el día después de la aplicación de spiperona (10 M) (C), pero no en el día bajo condiciones control (A). En AC, puntos de vista perpendicular de la reconstrucción 3D de los fotorreceptores de conejo, cerca de la corte se muestran. D) normalizado intensidad relativa de fluorescencia en función de la distancia de los cortes. E) los valores del espacio constante de los datos obtenidos en los experimentos D y otros (n = 3). *** P <0,001. Figura 5. Corte de carga revela que adaptada a la oscuridad células de conejo horizontal se trazador unido. Tanto de tipo A (A) y tipo B (B) en las células horizontales adaptados a la oscuridad retinas de conejo mostraron homóloga neurobiotin acoplamiento marcador.