包装HIV-またはFIVベースLentivector発現コンストラクト＆VSV-Gシュードウイルス粒子の伝達

1。 293TNパッケージングプラスミドを持つ細胞と発現コンストラクトのトランスフェクションシード7.0から8.0×10 4 mM L-グルタミン、4.5g / Lグルコース、抗生物質なしでウシ胎児血清（10％）を添加したDMEM培地を含む培養培地20mlで15 cm 2の培養プレートあたり6 293TN細胞。細胞密度は、トランスフェクション時の密集度60から80パーセントに達するように2〜5％のCOと37℃で18〜24時間培養する。いくつかのケースでは、標的細胞の形質導入のための十分に高い抗体価を得るために細胞の種のいくつかのプレートに必要となる場合があります。 細胞の各プレートについて、オートクレーブ2ミリリットルEppendorffチューブに1.6ミリリットルの無血清DMEMを追加します。上下にピペッティングしてDMEMとミックスに構築する45μlのごlentivectorのpPACKH1またはpPACKF1および4.5μgを追加します。 同じチューブにPureFectionの55μlを添加します。 10秒間ボルテックスする。室温fでDMEM-プラスミドPureFection混合物をインキュベートまたは15分。 組織培養プレートに均等にプレート全体に分散させる優しく滴と渦にDMEM-プラスミドPureFection混合物を追加します。インキュベーターに皿を返し、5％CO 2で37℃で成長します。 トランスフェクション後にメディアを変更する必要はありません。あなたのlentivectorコンストラクトは、GFPのような蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現した場合、12〜24時間トランスフェクション後、顕微鏡下であなたの細胞を確認してください。あなたは、トランスフェクションが成功したことを示す、> 90％GFP陽性細胞を見ることができるはずです。 50ミリリットル滅菌遠心管に細胞培養48時間後上清を72時間収集します。この細胞培養上清は現在、感染pseudoviral粒子を含んでいます。 （BSL-2の安全クラスを操作するための推奨ガイドラインに従ってください。）遠心1500×gで室温で15分間ペレット化し、細胞破片を。ペレットを乱さないように確保し、新しいチューブにウイルス上清を転送します。 ウイルスのパッケージングのために使用されている293TN細胞がバイオハザード容器に廃棄されるべきであり、ウイルスのパッケージングのさらなるラウンドのために使用されるようにされていません。 2。ウイルス上清の濃度レンチウイルス粒子含有上清のすべての4ボリュームに寒い（4°C）PEG-それはウイルスの降水ソリューションの1ボリュームを追加します。大量のレンチウイルス粒子の沈殿は、コーニングを250mlのポリプロピレン製遠心チューブで達成することができます。反転チューブを数回して、ソリューションを混在させることなく、混合物ボルテックスしないでください。 （最大4日でも可）少なくとも12時間4℃で溶液を冷蔵してください。冷凍工程の間にチューブを振ったり回転させないでください。 4℃で30分間1500×gで上清/ PEG-IT混合物を遠心分離℃に遠心分離後、レンチウイルス粒子がチューブの底にベージュや白のペレットとして表示されます。 supernataを注ぐNT。 ペレット中の沈殿したレンチウイルス粒子を乱さないように注意しながら、吸引することにより、流体の痕跡をすべて削除します。の痕跡が残存PEG-それはウイルスを希釈します（したがって、力価を減少させる）が、PEG-それは不活性で毒性はないので、標的細胞の整合性に影響を与えません。 再懸濁し、（4℃）寒い使用して、元のボリュームの1/100でレンチウイルス粒子を組み合わせて、滅菌リン酸緩衝生理食塩水またはDMEM、25 mMのHEPES緩衝液を含む。 使用直前まで滅菌低温バイアルおよび-70℃保存に分注し。 3。標的細胞のウイルスタイターと伝達我々は、標的細胞·オブ·関心を伝達し、実験間の一貫性を保つために、標的細胞に対して感染症の適切な多重度（MOI）を算出する前に、レンチウイルス粒子をタイ​​ターをお勧めします。ウイルスタイターのために、私たちは簡単に感染陽性対照ラインとしてHT1080細胞を使用することをお勧めします。 PLタイターのプロトコルを使用すると、パッケージ化されたレンチウイルス粒子の小アリコートでHT1080細胞を形質関与していることに注意して容易になります。力価が知られると、標的細胞·オブ·関心は生産レンチウイルス粒子でも導入することができます。 ：お勧めタイタープロトコルはで見つけることができますhttp://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7。 細胞培養培地で24ウェルプレートにウェル当たりプレート5万標的細胞·オブ·関心。細胞は通常、インチその指定された培養条件で細胞は一晩増殖培養したメディアを使用しています。細胞は伝達の日にコンフルエント％70から50の間でなければなりません。 伝達の日に、細胞から培地を吸引除去する。 1×の最終濃度（例えば、培養液500μlに2.5μlのTransDux）にTransDuxで培地を組み合わせたものです。その後TransDux-CEを転送各ウェルにLL培地の混合物。 各ウェルに標的細胞に対するMOI最適に対応するウイルスの適切な量をピペットで。最適なMOIが不明な場合、我々は異なるMOIでの範囲（例えば、MOI 1、2および5の組織培養細胞を簡単に感染、およびMOI多くの困難には1、10および20のように試すことをお勧め）初代細胞を感染させる。レンチウイルス粒子の濃度が（としてのウイルスタイタープロトコルを介して決定される）が知られていない場合は、ウイルスの別のボリュームはそのようなウイルスの1、2、5μlのように、試すことができます。ウイルスは72時間までのターゲット細胞と接触したままにすることができます。 ウイルスの構造が宿主細胞のゲノムに組み込まれた後に導入標的細胞·オブ·関心を持ってさらなる実験は、72時間導入した後に開始することができる。特定のニーズに応じて標的細胞·オブ·関心媒体と通路を変更します。 4。代表的な結果<pクラス= "jove_step"> 293TN細胞のトランスフェクション 293TN細胞の出発密度が成功したウイルスのパッケージングのために重要です。 293TN細胞はトランスフェクション（ 図2）の日コンフルエント-80 60％の間でなければなりません。 293TN細胞が60％コンフルエント未満である場合は、それらのトランスフェクションを実行する前に、数時間のために成長することができます。 293TN細胞が> 80％コンフルエントある場合は、トランスフェクションの前に再播種する必要があります。 lentivector表現するGFPを使用する場合は、293TN細胞の少なくとも90％が成功したトランスフェクション（ 図3）を示す、トランスフェクション後緑24時間蛍光を発するべきである。細胞の90％未満ではGFP陽性であるときは、このトランスフェクションが成功しなかったことを示し、ウイルス力価が低くなるため、次のステップに進みません。代わりに、新しいプレート293TN細胞と293TN細胞はトランスフェクション前に、適切な細胞密度であることを確認して、やり直してください。 293TN細胞は48〜72時間トランスフェクション後の組織培養プレートをやってのけることができます。これは負のレンチウイルス粒子の産生に影響を与えません。 HT1080細胞でタイターウイルス力価は、製造元の指示に従って、SBIのグローバル超高速タイターキットを使用して計算することができます。このシステムは、HT1080細胞にレンチウイルスベクターからWPRE配列のウイルスの統合を測定する定量PCRを利用し、正確にmlあたりの感染ユニット（図4）を測定するためのゲノム基準配列に基づいて、標準曲線を比較します。 標的細胞の伝達構成的に活性のGFPマーカーを発現するレンチウイルス粒子を使用している場合は伝達反応が動作している場合は、GFP陽性細胞は、形質導入の12から24時間以内に表示されるように開始する必要があります。レンチウイルスコンストラクトが安定トンに統合された後、GFPの発現は継続すべきである彼は細胞のゲノムをホストします。異なるMOIでで伝達する場合、低MOIでは、以下のGFPの蛍光を示し、高いMOIでは増加したGFPの蛍光を（ 図5）を示す場合には、GFPの蛍光は、約、MOIと一致する必要があります。 図1ウイルスの生産プロトコルの概要。 lentivectorとPPACKパッケージングプラスミドを混合し、293TN細胞に同時トランスフェクトされています。 48 -72時間後、ウイル​​ス上清を回収し、ウイルス粒子は、PEG-それを沈殿させる。レンチウイルス粒子をタイター後、彼らは標的細胞·オブ·関心を伝達するために使用することができます。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 293TN細胞の図2の位相コントラスト画像。セルdensityは60〜80％コンフルエントにトランスフェクションの日の間でなければなりません。 図3 24時間Purefection、pPACKH1、とlentivector構築するエンコーディングGFPのトランスフェクション後のGFP陽性293TN細胞の蛍光画像。 図4。WPREの定量PCRの結果とMOIおよびパッケージのウイルス粒子の対応する力価を計算するためにSBIのグローバル超高速タイターキットを用いて得られた標準曲線。 HT1080細胞の図5蛍光画像は、レンチウイルスの量が増加して導入した。画像は72時間後の形質からです。