Een live fluorescentie imaging techniek om de aanvulling en de mobilisatie van specifieke synaptische vesicles (SV) zwembaden in het centrum van zenuwuiteinden te kwantificeren wordt beschreven. Twee rondes van SV recycling worden bewaakt in dezelfde zenuwuiteinden die een interne controle.
Na het vrijkomen van neurotransmitters in het centrum van zenuwuiteinden, zijn SVS snel opgehaald door endocytose. Opgehaalde SVS worden dan gevuld met neurotransmitter en weer aan de recycling zwembad, gedefinieerd als SVS die beschikbaar zijn voor exocytose 1,2. De recycling pool kan in het algemeen onderverdeeld worden in twee verschillende zwembaden – de gemakkelijk losneembaar zwembad (RRP) en de reserve zwembad (RP). Zoals hun naam impliceert, de adviesprijs bestaat uit SVS die onmiddellijk beschikbaar zijn voor fusie, terwijl RP SVS worden pas vrijgegeven tijdens intense stimulatie 1,2. Het is belangrijk om een betrouwbare test die het verschil aanvulling van deze SV zwembaden rapporten om een te begrijpen) hoe SVS-verkeer na verschillende vormen van endocytose (zoals clathrine-afhankelijke endocytose en activiteit-afhankelijke bulk endocytose) en 2) de mechanismen het beheersen van de mobilisatie van zowel de RRP en RP in reactie op verschillende stimuli.
FM kleurstoffen worden routinematig werked naar SV omzet kwantitatief rapport in het centrum van zenuwuiteinden 3-8. Ze hebben een hydrofobe koolwaterstof staart die omkeerbaar wanden maken het mogelijk in de lipide bilaag, en een hydrofiele kopgroep die blokken passage over membranen. De kleurstoffen hebben weinig fluorescentie in waterige oplossing, maar hun quantum opbrengst drastisch toe wanneer opgedeeld in membraan 9. Zo FM kleurstoffen zijn ideaal fluorescerende probes voor het opsporen van actieve recycling SVS. Het standaard protocol voor het gebruik van FM-kleurstof is als volgt. Eerst worden ze toegepast op de neuronen en worden opgenomen tijdens de endocytose (figuur 1). Na de niet-geïnternaliseerde kleurstof wordt weggespoeld uit het plasma membraan, gerecycled SVS verdelen binnen de recycling zwembad. Deze SVS worden vervolgens uitgeput met het lossen stimuli (figuur 1). Omdat FM kleurstof etikettering van SVS is quantale 10, de resulterende fluorescentie daling is evenredig aan de hoeveelheid vrijgekomen blaasjes. Zo, de recycling en de fusie van SVS gegenereerd uit de previous ronde van endocytose betrouwbaar kan worden gekwantificeerd.
Hier presenteren we een protocol dat is aangepast om twee bijkomende elementen van de informatie te verkrijgen. Ten eerste worden sequentiële lossen stimuli gebruikt om differentieel lossen het RRP en de RP, tot kwantificering van de aanvulling van specifieke SV zwembaden mogelijk te maken. Ten tweede, elke zenuw klem ondergaat het protocol twee keer. Zo kan de reactie van dezelfde zenuw terminal op de S1 worden vergeleken met de aanwezigheid van een teststof in fase S2 (Figuur 2), het verstrekken van een interne controle. Dit is belangrijk, omdat de omvang van SV recycling in verschillende zenuwuiteinden is zeer variabel 11.
Alle aanhangend primaire neuronale culturen kan worden gebruikt voor dit protocol, maar de plating dichtheid, oplossingen en stimulatie voorwaarden zijn geoptimaliseerd voor de kleine hersenen granule neuronen (CGNs) 12,13.
FM kleurstoffen worden op grote schaal gebruikt voor het zenuwuiteinde functioneren in veel neuronale voorbereidingen te onderzoeken. Ze zijn voornamelijk gebruikt om de omvang van een van beide SV endocytose, SV omzet of de kinetiek van exocytose 6 monitor. De beschreven protocol breidt deze studies te onderzoeken of het differentieel lossen van specifieke SV zwembaden. Dit biedt extra informatie met betrekking tot de aanvulling van SV zwembaden en ook hun mate van mobilisatie.
FM-kleurstoffen kunnen worden gebruikt om meerdere rondes van SV-label recycling binnen dezelfde zenuwuiteinden. We hebben benut deze eigenschap en ontworpen protocollen waarin de SV omzet in elke terminal twee keer kan worden gecontroleerd in dezelfde zenuwuiteinden. Dit zorgt voor een nauwkeurige interne controle, die is hoofdzakelijk te wijten aan de heterogene aard van de SV recycling in parallel zenuwuiteinden 11. Via het gebruik van de S1-fase als een interne controle, het vullen van het RRP, RP en de totaleSV zwembad in de aanwezigheid van drugs betrouwbaar en rechtstreeks worden vergeleken.
Naast het verstrekken van informatie over de absolute omvang van de recycling, RRP en RP zwembaden onder verschillende stimulatie omstandigheden kan dit protocol ook gegevens voor de volgende – 1) De verdeling van SVS tussen de RRP en RP als functie van de recyclage-pool voor S1 en S2, 2) de relatieve omvang van de S2 zwembaden (RRP en RP) als een functie van in totaal S1 recycling zwembad en 3) de relatieve omvang van een gedefinieerde SV zwembad in S2 als een functie van hetzelfde zwembad in S1. Deze bijzondere protocol zal echter niet informatie over lossen kinetiek, sinds de overname te langzaam is (voor de kinetische metingen acquisitie keer moet zo snel mogelijk en lossen automatisch gesynchroniseerd om de afbeelding vast te leggen).
Onze 30 Hz 2 s stimuli roept een identieke omvang van RRP lossen om hypertoon sucrose 8. Aangezien de grootte van de RRPwordt bepaald door hypertone sucrose lossen 15, kunnen we stellen dat dit protocol alle RRP SVS ontlaadt, in overeenstemming met studies in hippocampale neuronen 16. De reserve zwembad is bijna volledig uitgeput door drie treinen van 400 stimuli (40 Hz 10 s per stuk) omdat dit de stimulatie lost een identieke hoeveelheid kleurstof aan een paradigma (2 stimuli met 50 mM KCl) dat 95% van alle dye-label SVS uitput 8,17. Nauwkeurige kwantificering van de omvang van zowel het RRP en reserve zwembad is ook afhankelijk van het verwerven van informatie binnen de lineaire dynamische bereik van de CCD-camera.
Deze eenvoudige protocol kan ook verder worden gewijzigd. De kracht van het laden stimuli kan ook worden gevarieerd om te bepalen hoe neuronale activiteit en de verschillende modi endocytose invloed SV zwembad aanvulling. Bovendien kan meer dan twee cycli van laden en lossen ook uitgevoerd worden indien nodig. Dit protocol kan ook gebruikt worden in cellen getransfecteerd met ofwel overexpressie ofshRNA vectoren. Door de lage transfectie-efficiëntie van de primaire neuronale culturen, moet tot expressie gebrachte eiwitten worden gelabeld met fluorescerende eiwitten. Het is essentieel dat deze fluorescerende labels niet interfereren met het FM-signaal kleurstof (gebruik cyaan of rood eiwitten, bijvoorbeeld). In dit geval kan zenuwuiteinden van de getransfecteerde en niet-getransfecteerde cellen in hetzelfde gezichtsveld ook vergeleken worden als een extra controle acht. In dergelijke experimenten een vergelijking van de mate van belasting tussen de S1 en S2 lasten is van weinig waarde, omdat de storing aanwezig is tijdens beide belastingen. Verdeling van kleurstof tussen SV zwembaden kunnen echter nog steeds acht in beeld worden gebracht.
Genetische verslaggevers genoemd pHluorins kan ook worden gebruikt om SV exocytose en endocytose in primaire neuronale cultuur monitor. Deze probes gebruik van een pH-gevoelige groen fluorescerend eiwit om de pH-omgeving van luminale domeinen van gelabeld SV eiwitten zoals VAMP, synaptofysine en VGLUT1 18 </sup>. Bij gebruik in combinatie met vesiculaire ATPase remmers, kan pHluorins melden zowel de kinetiek en de omvang van SV pool mobilisatie 19. De FM-kleurstof gebaseerde aanpak hier beschreven heeft een aantal voordelen ten opzichte van de pHluorin techniek, Ten eerste, FM-kleurstoffen informatie waarop SV endocytose-modus vult het RRP en reserve zwembaden 8. Ten tweede specifieke SV zwembaden kunnen gelabeld worden met FM kleurstoffen die verschillende spectrale eigenschappen hebben 20 en ten slotte is er geen vereiste voor transfectie. FM kleurstoffen kunnen geen informatie over SV verkeer tussen de rust-en recycling SV zwembaden echter (in tegenstelling tot pHluorins 19), omdat per definitie SVS te worden geladen met kleurstof tijdens de endocytose zichtbaar moeten zijn. Dus zowel de FM-kleurstoffen en pHluorins hebben sterke en zwakke punten en zijn zeer krachtig wanneer deze gebruikt worden in onafhankelijke experimenten op dezelfde vraag te pakken.
Beelden van hoge kwaliteit zijn essentieel voor geldige analyse en reproducible resultaten. Terwijl de horizontale drift kan gemakkelijk worden gecorrigeerd, kunnen experimenten waar sprake is van een drift in de Z-as niet meer worden hersteld. Om deze reden is het belangrijk om foto's opnieuw te richten alvorens de S1 en S2 laadt. In gevallen waarin een belangrijke tl-verval is opgetreden, kan verval correcties worden toegepast (meestal door het aftrekken van een eerder opgenomen spoor van de FM-geladen cellen in de afwezigheid van stimulatie). Het is echter gesuggereerd dat verval correctie alleen wordt uitgevoerd voor de grafische weergave en niet om gebruikt te worden voor een kwantitatieve analyse.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Wellcome Trust (Ref: 084277).
Name | Company | Catalogue no. |
---|---|---|
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution B | – | – | 19 ml |
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution C | – | – | 3.2 ml |
Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
Solution B | – | – | 10 ml |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
Name | Version | Company |
---|---|---|
AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)