Percussão Fluid lateral: Modelo de Lesão em Ratos

1. Craniectomia Um site cirúrgica estéril é preparada incluindo um instrumento de alinhamento estereotáxica (Instrumentos Kopf) para os ratos com um mouse titular cabeça de gás anestésico (Kopf Instruments) conectado a um aparelho de anestesia com O 2 flush (Parkland Científica) para permitir a inalação contínua de isoflurano durante a cirurgia . Um bloco de aquecimento mantida a 37 ° C está posicionado sob o mouse durante a cirurgia. Um microscópio cirúrgico e fonte de luz é necessária. O experimentador deve vestir um jaleco, máscara cirúrgica, cobrindo o pé, luvas, ea cobertura da cabeça. Todas as ferramentas e materiais que em contato com o sítio cirúrgico devem ser esterilizados. Um hub lesão, que consiste na final feminina de um Luer-lok, é criado por cortar a ponta de metal de um g 20 1 ½ agulha "(Becton Dickinson), com uma lâmina de barbear. O hub deve ser cortado com um leve desvio e ter uma abertura de diâmetro aproximadamente 3mm interior. O trépano (veja o passo 1.10) pode ser usado para medir e fabricar um hub lesão do diâmetro correto. Um hub é necessária por animal. O hub será ligado ao crânio e ligado à LFP dispositivo para fornecer o pulso de pressão. Cabo de nylon sólido (1,7 mm de diâmetro, por exemplo, linha de trimmer erva daninha) é cortado em discos ~ 1 mm de espessura usando uma lâmina de barbear. Mais uma vez, um disco é necessário por animal. Isto é usado para estabilizar a trefina durante a realização da craniectomia (veja o passo 1.10). Ratos podem ser de qualquer estirpe e idade (que usam principalmente C57BL / 6 idades 1-9 meses). O mouse é pesado e anestesiados em uma câmara de indução pequenas (pré-carregada com 4-5% de isoflurano em 100% O 2) durante pelo menos 1 minuto. Para analgesia preemptiva, uma injeção de buprenorphrine (0,1 mg / kg) é dada por via intraperitoneal eo mouse é colocado de volta para dentro da câmara por mais um minuto. Esquema analgésico deve ser confirmado por consulta com o uso de animais locais e da comissão cuidado. O cabelo no alto da cabeça do rato é cortado o mais próximo da pele possível. O rato é posicionado em um instrumento de alinhamento estereotáxica equipado com mordida banhado destina a administrar anestesia gás volátil (Kopf Instruments). O nível do gás isoflurano é reduzido para 2% ou efeito. Taxa de respiração é monitorada visualmente durante a cirurgia. Outros parâmetros fisiológicos, tais como gases de sangue (p O 2, p CO 2), o pH do sangue ou pressão arterial pode ser medida através de equipamentos apropriados durante o procedimento. Lágrimas artificiais pomada lubrificante é colocado sobre os olhos do mouse usando um aplicador de algodão para mantê-los de secagem. Iodopovidona é aplicado na pele entre os olhos eo pescoço com um aplicador de algodão seguido pelo álcool 70%. A aplicação de iodopovidona e álcool é repetido para um total de 3 vezes. A incisão é feita no couro cabeludo linha média dos olhos até o pescoço com um bisturi (lâmina # 15) ea pele retraída com um bulldog grampos pequenos (Ferramentas Ciência Belas # 18050-28) para expor o crânio e proporcionar um campo livre cirúrgico. Os grampos de bulldog pendurar fora das bordas laterais do crânio. Anestésico tópico bupivacaína (0,025% em soro fisiológico) é aplicada ao crânio com um aplicador de algodão e da fáscia é raspado do crânio com a ponta da ferramenta dental ou raspador de osso (por exemplo, ferramentas Ciência Fine, # 10075-16). Um marcador permanente é usado para marcar o crânio a meio caminho entre bregma e lambda e entre a sutura sagital e rebordo lateral sobre o hemisfério direito (~ 2 mm direita da linha média). Uma gota de cola de cianoacrilato Loctite (Loctite Pak Tak 454) é colocado em um plástico pesam barco e lado pinça de apreensão (Ferramentas Ciência Fine, Dumont n º 6) são usados ​​para mergulhar um disco de cabo de nylon de plantas daninhas sólido (ver 1.3 acima) para o cola e em seguida, pressione o disco sobre a marca no crânio. Uma a duas gotas da Loctite Accelerator é entregue em cima do disco usando uma seringa de 1ml e 26 08/03 agulha G para causar o endurecimento da cola. Adesão de teste do disco com o crânio antes de prosseguir. Lugar de 3 mm diâmetro externo trefina (Investigação Loja Instrumentation, University of Pennsylvania) sobre o disco e gire no sentido horário até que você cortar crânio. Verificar o progresso do trépano de freqüência para evitar a perfuração demasiado distante no crânio e romper a dura-máter. Haverá um enfraquecimento do crânio em torno do perímetro do disco ea aba do crânio vai se sentir solta quando pressionado levemente. Coloque a ferramenta dental paralela / horizontal na superfície do crânio para erguer sob o crânio e levantar o retalho ósseo para cima. Retire o osso do crânio, com fórceps. Se houver uma pequena quantidade de sangramento, sem comprometimento da dura-máter, use um aplicador de algodão para aplicar pressão até o sangramento parar e evitar que o pó de osso de ficar para a dura. No entanto, se há uma brecha na dura como hérnia de que é visível, o animal deve ser eliminado do experimento de eutanásia humanitária. Esta etapa requer prática suficientepara alcançar a habilidade cirúrgica necessária. Utilizando uma pinça, manter o hub lesão na posição sobre a craniectomia no crânio para que o viés do hub está alinhado com a curvatura do crânio (ou seja, o mais borda do cubo encontra-se perto do cume lateral do crânio). Enquanto isso, usando um bastão de madeira, cortado em um ângulo com uma lâmina de barbear para ter uma ponta afiada, aplicar gel super-cola em torno das bordas externas do cubo com a mão oposta e estabilizar o hub até que seja afixado em posição vertical em cima do buraco. Cuidados devem ser tomados para não se cola em cima da dura-máter. Cola na dura causará uma atenuação da lesão. Usando um copo de papel pequena, misture metilmetacrilato acrílica dental (Liquid Jet Acrílico com Resina Perm reembasamento / Repair, Butler Schein) para criar uma solução viscosa. Use uma seringa de 1 cc sem agulha acoplada para aplicar cimento em todo o hub lesão. O cimento deve cobrir a 2 mm inferior do hub lesão, bem como o crânio em torno expostos. As suturas do crânio são seladas com o cimento para garantir que o bolo líquido da lesão permanece dentro da cavidade craniana. Preencher o hub com NaCl 0,9% estéril (soro fisiológico), utilizando uma seringa e agulha embotados. A solução salina irá manter a umidade dura durante a fase de recuperação. Além disso, se o hub lesão não ficar cheio, que vai indicar um vazamento na conexão hub ao crânio e um novo centro deverá ser anexado. O mouse deve ser dada uma injeção de 0,25 ml de solução salina estéril IP, retirado do instrumento de alinhamento estereotáxica e colocado em uma gaiola vazia, sem tampa bar fio em uma placa de aquecimento. Coloque alguns hydragel no fundo da gaiola e permitir que os ratos se recuperar para 1-2 horas. 2. Indução de lesão Ligue o osciloscópio (Tektronix TDS 1001B, dois canais do osciloscópio de armazenamento Digi 40 mHz, 500Ms.s) e amplificador (Trauma Indutor Amplificador transdutor de pressão) que é conectado ao dispositivo de LFP. Confirmar que o dispositivo de LFP (Design personalizado e Fabricação, Virginia Commonwealth University) e da tubulação de alta pressão (comprimento 41 centímetros, volume de 2ml, Baxter # 2C5643) conectados a ele são preenchidos com água estéril e livre de bolhas de ar. No final do tubo é uma peça Luer-lok masculino. Com o fim Luer-lok da tubulação fechada, entregar impulsos de teste, liberando o pêndulo. O dispositivo deve ser preparado, fornecendo cerca de 10 pulsos de teste. Confirmar que dá sinal de pêndulo suave no osciloscópio e um amplificador. Um sinal de ruído indica ar no sistema que devem ser removidos antes de entregar o pulso lesão. A duração do pulso deve ser cerca de 20 ms. O amplificador transdutor fornecido com o dispositivo de LFP é calibrado de tal forma que 10 mV = 1,0 libras por polegada quadrada (PSI). Uma atmosfera (ATM) = 14,7 PSI. Ferimento pressões entregues são tipicamente na faixa de 0,9-2,1 atmosferas para produzir uma gama de corrigir vezes reflexo e um aumento da mortalidade associada com edema pulmonar. Lesão leve é ​​considerado um momento de reflexo de endireitamento 2-4 min e um 0 – Taxa de mortalidade de 5%. Lesão moderada é considerado um tempo de reflexo de endireitamento de 6-10 min e uma 10 – taxa de mortalidade de 20%. Se necessário, ajustar o ângulo do pêndulo para aumentar ou diminuir a intensidade do pulso. O ângulo de posição inicial do pêndulo é de aproximadamente 10 graus. Depois de ajustar o dispositivo de LFP, certifique-se de abrir o final Luer-Lok da tubulação. O rato é colocado na câmara de anestesia 05/04% isoflurano (pré-carregada) até que um plano cirúrgico de anestesia é alcançado. O rato é colocado sobre uma plataforma ao lado do dispositivo LFP eo hub é preenchido com solução salina estéril. A tubulação do dispositivo LFP com um macho Luer-lok é anexado ao encaixe Luer-lok fêmea do hub. O animal é colocado de lado e uma vez por currículos padrão normal de respiração, mas antes de o animal recuperar a consciência completa (~ 2 min), o pêndulo do dispositivo LFP é liberado para fazer com que um único pulso de lesão. É importante para não induzir a lesão, enquanto o animal é anestesiado demais porque poderia causar insuficiência respiratória e morte. A pressão exata do pulso deve ser gravado. Ileso, animais sham submetidos a todos os mesmos procedimentos com a exceção do pulso de fluido real para induzir a lesão. O animal deve ser imediatamente removido do dispositivo LFP e colocou em suas costas para monitorar o tempo de reflexo de endireitamento. Depois que o rato tem se endireitou, é então brevemente novamente anestesiados eo cimento e hub removida junto do crânio com a mão. O couro cabeludo é então fechada com tecido Vetbond adesivo (3M), sutura ou grampos. Qualquer herniação da dura-máter ou oclusão do hub é anotado. Um hub ocluída irá produzir uma lesão atenuada de magnitude desconhecida. O animal é colocado de volta na gaiola em uma almofada de aquecimento até ambulatorial e depois voltou para sua gaiola. 3. Avaliação do motor, cognitivo e resultados histológicos O motor déficits causados ​​pela LFP pode ser determinada através do teste rotarod, um indicador de vestibulomotor integrado e função sensório-motora 21. Todos os animais devem ser testados antes da lesão para determinar uma leitura de base e para aclimatar os animais para o paradigma. Os ratos são treinados no dispositivo rotarod 3 vezes por dia com intervalos de 1 hora intertrial para os dois dias antes da lesão. A latência se equilibrar em um diâmetro de 36 milímetros exterior, girando vara, que tem uma superfície de borracha é medido. A velocidade aumenta 4-40 rpm em um intervalo de 180 segundos. Cada ensaio termina quando o animal cai da rotarod. Em momentos diferentes após a lesão (tipicamente 1, 7 e 21 dias), os ratos são novamente testados no dispositivo rotarod. Avaliação de testes rotarod após a lesão é baseada na pontuação individual em relação às latências sua linha de base 22. A latência média de queda de ratos feridos é comparada com a dos ratos sham. LFP seguinte função cognitiva pode ser testado em um conjunto separado de ratos usando o labirinto aquático de Morris (MWM), uma medida sensível da memória pós-traumático aprendizagem e de trabalho espacial em roedores 23. Os ratos são aclimatados ao paradigma e testado para uma resposta de base usando um teste de plataforma visível 4 dias antes da lesão. A piscina branca circular (1 m de diâmetro) é preenchido com água e tinta não tóxica branca. A plataforma é feita usando um sinal visível ou marcador e sem pistas visuais estão nas paredes. Mais de 4 ensaios, o mouse é colocado no quadrante oposto ao da plataforma visível, ea latência para encontrar a plataforma é medido. Tempo de julgamento máximo é de 60 segundos e permanece ou o mouse é colocado sobre a plataforma por 15 segundos ao final de cada julgamento. O intervalo é de 5 min intertrial durante o qual o mouse é aquecido em uma almofada de aquecimento. A plataforma é movido para um quadrante diferente para cada ensaio e quatro ensaios são realizados. Para avaliar a aprendizagem, os ratos são treinados sobre a MWM usando uma plataforma escondida fixo em um dos quatro quadrantes em vários pontos do tempo após a lesão (tipicamente de 1, 7 e 21 dias). Pistas em preto e branco são colocados nas paredes. O quadrante em que o mouse é colocado é pseudorandomly variado ao longo da formação e tempo para localizar a plataforma é registrado. Tempo de julgamento máximo é de 60 segundos e permanece ou o mouse é colocado sobre a plataforma por 15 segundos e aquecido por 5 min entre os testes. Ratos são submetidos a 8 ensaios / dia durante 3 dias consecutivos. Para avaliar a retenção da memória, os animais são submetidos a um julgamento sonda 60 seg do dia seguinte ao último treinamento. Durante o julgamento da sonda, a plataforma é removido para determinar o tempo gasto ea distância nadada no quadrante onde a plataforma costumava ser. Finalmente, um teste de plataforma visível é feito para governar para fora do motor e possíveis déficits visuais que se desenvolveu após a lesão. Para determinar as conseqüências da lesão histológica LFP, o tecido é fixado por perfusão intracardíaca em 0,9% NaCl seguido de paraformaldeído 4% em pontos de tempo desejado após a lesão. Tecido é postfixed overnight a 4 ° C e depois cryoprotected em 10% e 30% da solução de sacarose e incorporação. Congelados cortes seriados são cortados em um criostato e processados ​​usando várias técnicas immuohistochemical e histológicas. 4. Resultados representativos: A lesão induzida pelo dispositivo de LFP é reproduzível de animal para animal, especialmente com treinamento cirúrgico suficiente. Para manter a consistência da lesão, a quantidade de pressão entregues à dura pelo dispositivo é monitorado. O pêndulo atinge um cilindro cheio de água acrílico com alta pressão tubulação e Luer-lok montagem que é conectado ao hub lesão afixada no local craniectomia sobre o animal (Figura 1A). Para uma lesão leve a moderada, o ângulo do pêndulo é configurado para gerar uma pressão que varia 0,9-2,1 atm e um osciloscópio ligado a um amplificador é utilizado para visualizar o pulso de pressão (Figura 1B). Ferimento produz uma gama de corrigir vezes reflexo e um aumento da mortalidade associada com edema pulmonar. Lesão leve é ​​considerado um momento de reflexo de endireitamento 2-4 min e um 0 – Taxa de mortalidade de 5%. Lesão moderada é considerado um tempo de reflexo de endireitamento de 6-10 min e uma 10 – taxa de mortalidade de 20%. Além disso, ratos submetidos a LFP podem apresentar postura tônica que podem ser indicativos de apreensão. Apreensão é freqüentemente associada com uma dura comprometida. Juntas, essas descobertas sugerem que a lesão está causando danos neurológicos. Animais Sham são conectado ao dispositivo de LFP, mas o pêndulo não é liberado. Para visualizar o dano induzido por LFP, temos realizado imunocitoquímica utilizando anticorpos que reconhecem os astrócitos e macrófagos sendo que ambos são tipos de células associada com uma resposta à lesão. Glial fibrilar proteína ácida coloração (GFAP) revela gliose aumentou em todo o córtex na região da lesão whratos sham ereas não exibem astrocitose aumento equivalente no site abaixo da craniectomia (Figura 2A, B). Da mesma forma, MAC1 coloração demonstra mais macrófagos em torno do local da lesão em comparação com camundongos submetidos à cirurgia sham. Além disso, não há danos físicos com freqüência para o tecido cortical visível em ratos submetidos a LFP, mas não em ratos sham (Figura 2C, D). Testes comportamentais após LFP leve pode ser usado para avaliar os resultados cognitivos e motor. MWM é usado para determinar os efeitos na aprendizagem e memória. Utilizando pistas visuais na sala de testes, os ratos sham rapidamente tornou-se mais eficiente em localizar a plataforma a cada dia subseqüente de formação no labirinto de água. Ratos submetidos a LFP leve demorar mais tempo para localizar a plataforma escondida nos dois primeiros dias de testes em relação aos ratos sham mas depois aparecem para aprender a tarefa até o terceiro dia (Figura 3A). Estes achados sugerem que a lesão reduz a velocidade com que os ratos podem adquirir aprendizado espacial. Para determinar o efeito da lesão na retenção da memória, um ensaio sonda é realizada um dia após a última sessão de treino. Ratos Sham passar mais tempo no quadrante alvo em comparação com os ratos submetidos a LFP leve sugerindo que a lesão tenha afetado a capacidade dos camundongos lembrar a localização de onde a plataforma utilizada para residir (Figura 3B). Para avaliar a função locomotora, os ratos são testados no dispositivo rotarod. Ratos submetidos a LFP leve têm menor latência média a cair em comparação com os ratos sham em 1, 7 e 21 dias pós-lesão (dpi) (Figura 3C). Estes dados sugerem que os ratos feridos ter prejudicado vestibulomotor integrado e função sensório-motor. Figura 1. Dispositivo de LFP e um traço representante do osciloscópio obtidos durante a lesão. A) Os componentes do dispositivo de LFP são: o pêndulo fixo a um suporte e fixado em um ângulo pré-determinado para entregar a força desejada, a água encheu cilindro de acrílico com tubulação de alta pressão e um encaixe Luer-lok masculino em anexo, um amplificador, e um osciloscópio. B) trace Representante do pulso de pressão de osciloscópio. O valor de pico a pico é de 2,16 volts, indicando uma pressão de 1,47 atm. Figura 2. Gliose melhorada e uma resposta inflamatória seguintes LFP demonstra a extensão da lesão. Congelados secções transversais (20Hm) através do cérebro de um rato submetido a cirurgia sham (A, C) ou lesão LFP (B, D) 7 dias após a lesão (dpi). Imagens corticais são tomadas no epicentro da craniectomia. (A, B) de tecido é corado com um anticorpo para identificar astrócitos. Glial fibrilar proteína ácida de anticorpos (GFAP) (MAB360, Chemicon, 1:400) revela um maior número de astrócitos em todo o córtex do rato submetido a LFP lesão (setas) em relação à cirurgia sham. Anticorpo secundário é cabra anti-camundongo 594 (1:1000). (C. D) tecido é corado com um anticorpo para identificar macrófagos. MAC1 anticorpos (MAC1-alfa da cadeia CD11b, BD Biosciences, 1:50) revela macrophges mais e / ou ativados microglia em torno do local da lesão no córtex (setas) em relação à cirurgia sham. Anticorpo secundário é rato de cabra anti Cy3 (1:50). Barra de escala = 200μm em A e B, 100μm em C e D. Figura 3. Seguintes testes comportamentais LFP leve demonstra déficits de feridos em comparação com ratos sham. A) Os ratos submetidos a LFP leve demorar mais tempo para aprender a tarefa de encontrar a plataforma na MWM do que os ratos sham. Sham vs LFP (segundo av ± SEM) 1 dia 34,21 ± 3,02 vs 38,64 ± 2,63; 2 dias 24,52 ± 2,84 vs 27,21 ± 2,11; 3 dias 22,47 ± 2,00 vs 22,08 ± 2,52 (1 dpi, n = 9 sham, 10 LFP) . B) Os ratos submetidos a LFP leve gastar menos tempo no quadrante alvo durante a sonda hr ensaio de 24 após o último treinamento na MWM relativa aos ratos sham (21 dpi, n = 10). C) Os ratos submetidos a LFP leve cair o dispositivo rotarod mais cedo do que os ratos sham (1, 7, e 21 dpi, n = 5 sham, 8 LFP). Barras de erro representam SE.