Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

1. CoCl 2 çözüm indüklediği hipoksi Kobalt (II) Klorür hekzahidrat ve (CoCl 2 • 6H 2 O, MW = 237.9), hipoksi-indüklenebilir faktör-1.3 8 indükleyen kimyasal bir madde. Bu ürün, açık, kırmızı bir çözüm verimli, su (100 mg / ml) çözünür. 25mm bir stok solüsyonu steril gg su hazırlayın, (hemen önce kullanıma hazırlamak) Hipoksi ikna etmek için normal bir hücre kültürü medya 100μM son konsantrasyonda CoCl 2 kullanın . Hücrelere CoCl 2 içeren medya ekleyin ve kültürlerin geleneksel bir inkübatör 24 saat inkübe (37 ° C,% 5 C0 2). Yukarıdaki konsantrasyonu hücre hatları için test ettik ama her hücre hattı, ilaca bağlı toksisite sınırı ve tahlil optimize etmek amacıyla çeşitli inkübasyon sürelerinde yanı sıra çeşitli konsantrasyonlarda (doza bağımlı bir eğri kurmak için) test edilmelidir çalışır. 2. Modüler İnkübatör Odası indüklediği hipoksi En az iki özdeş (ikiz kültür) hücre kültürleri hazırlayın. Hücre kültürleri, şişeler, tabak ya da kültür yemekleri olabilir. Odanın açmak için, ilk oda (hipoksik gaz tasfiye enjeksiyon / için kullanılan tüpler) ve yavaşça, çelik halka kelepçe açık bağlı borular üzerinde bulunan iki beyaz plastik kelepçeleri açın. Kelepçe bırakın. Kapak ve tepsiler artık kaldırılabilir. Hipoksik odasında hücre kültürü yerleştirin. Ayrıca odasında kültürlerinin yeterli nemlendirme sağlamak için steril su içeren bir Petri kabı yerleştirin. Normoxia "ikiz" hücre kültürü kontrolü yerleştirin. Tepsiler güvenli ve hareket etmiyor ve sonra kapağı odasına yakın emin olun. Doğru odasının Hermetik kapanmasını sağlamak ve bunu kapatmak için çelik halka kelepçe yerleştirin. Hipoksi oluşturmak için,% 1 O 2 gaz karışımı içeren bir "hipoksi tankı" tüp takın. Tankına bağlı bir debimetre varsa odasına doğrudan gaz tankı-debimetre odacıklı () bağlı olacaktır. Biz regülatör kurulmuş bir debimetre kullanın. Bunu yapmak için 7-10 dakika dakika başına 20 litre akış hızında gaz tankı açarak odasına floş odasında ve medya tüm oksijen mevcut, eğer en kaldırmak için önemlidir; sonra hızlı bir şekilde kapatmak- gaz akışı ve odanın her iki beyaz kelepçeler kapatarak tamamen kapatın. Zaman istenilen süre için geleneksel bir inkübatör odasına dönün. 2 saat sonra tekrar aynı hizada büyük kültürleri kullanıyorsanız, 1 için de gaz kültürlerde medya izin verir. Yukarıdaki adımları yapıcı öneriler '(Billups-Rothenberg, Inc.) Dayanmaktadır. Gaz tankeri, her zaman için güvenli olduğundan emin olun. Notlar: 1-3hours sonra yeniden gaz odasına kez tavsiye medya bulunan O 2 ortadan kaldırmak için. 48hours daha uzun inkübasyon süresi için de yeniden gaz odasına tavsiye edilir. O 2 hücre / odasında yer alan ölçümleri sağlayan oksijen sensörleri (elektrotlar / manometre), oda / hücre içi O 2 içerir) daha hassas ölçüm sağlayacaktır . Bir zaman eğrisi yapmak için çeşitli süre kültür hücrelerinin belli hücreleri HIF-1α uygun zaman ifade belirlemenize yardımcı olacaktır. 3. Hipoksi Değerlendirilmesi Western blot HIF-1 α algılama. Yeniden açın odası olarak bölüm 2.2 'de açıklanan ve hemen buz üzerinde kültürler yerleştirin. Plakalar% 5 SDS çözümü ile hipoksi arıtılmış ve arıtılmamış hücreler Lyse sonra, tüpler sonikasyon, yavaşlatmayı hücre artıkları hücre lyzate transferi ve süpernatantı toplamak. Tedbir protein konsantrasyonu BCA kiti kullanılarak, 5 dakika boyunca 95 yükleme tamponu ve ısıtma ° C ekleyerek örnek hazırlayın. % 8 SDS-poliakrilamid jel ve Selülozik membranlara transfer Electrophorese proteinler. 1 saat oda sıcaklığında veya çalkalayıcı üzerinde 4 ° C gecede% 5 yağsız kuru süt içeren PBS membran ve% 0.1 Tween 20 engelleyin. 4 aynı tampon anti-HIF-1α birincil monoklonal antikor (1 / 600) bir gecede immüno ° C. PBS PBS içinde HRP-ikincil antikor (1 / 2000) +% 0.1 Tween 20 45 dakika oda sıcaklığında, 5dakika her zaman ve inkübe% 0.1 Tween 20 içeren 3 kere yıkayın. PBS, 5dakika / saat oda sıcaklığında% 0.1 Tween 20 içeren 3 kere yıkayın. Protein bandı göstermek için Pierce ECL kiti ve X-ray film kullanın. Hipoksi Duyarlı Elemanlar (HRE). HIF-1α Hipoksi Düzenlenmesi Element (HRE) olarak adlandırılan bir dizi bağlanarak çok sayıda genler (yani VEGF, EPO) düzenler. HRE ilişkili bir marker gen I9 HIF aktivite tespit etmek mümkündür. Bu yöntemi kullanmak için, önce hücrelerin adapte transfeksiyon yöntemi kullanılarak HRE lusiferaz plazmid hücreleri transfect gerekir. Örneğin biz Lipofectamine 2000 kullanılır. Hücreler hipoksi ve normoxia inkübe önce, en az 4 saat transfekte olması gerekiyor. Bu sefer, bu ilk adım, hipoksi etkilenmez, böylece DNA'nın hücrelere girmek için izin verir. Lusiferaz sinyal Lusiferaz Assay Kit kullanılarak tespit edilmiştir. Hipoksi, modüler odasında HRE-transfekte hücreler inkübe veya CoCl 2 ile inkübe HRE transfekte hücreleri normoxia kontrolü içerir. Istenilen bir kuluçka döneminden sonra, hücre büyümesi orta çıkarın. PBS içinde hücreler durulayın, PBS çıkarın. Kültür çanak içine 400μl 1X reaktifi Uygulama ve ekli hücreleri kazıyın, sonra onları bir mikro tüp transferi. Kısa süreli santrifüj Pelet enkaz. Mix 20μl hücre Lusiferaz Testi Reaktif 100μl supernatant lizatları ve lüminesans lüminometre kullanarak ölçmek. 4. Temsilcisi Sonuçlar: K562 hücrelerinin (insan lösemi hücre hattı) normoxia kıyasla düşük oksijen kültürlü 2 gün, hipoksi western blot (Şekil 1) tespit edildi HIF-1α protein bir artışa neden olur. HRE lucifeares, hipoksi kültür (embriyonik böbrek hücre hattı) 293 hücreler değiştirilen önemli bir HIF-1α aktivitesi artmış hipoksik hücreleri tespit edildi (Şekil 2). Kullanarak Şekil 1: hipoksik hücrelerin HIF-1α artırın. K562 hücrelerinin 48 saat için normoxia ve hipoksi (hipoksik odasına) kültür ve HIF-1α için özel bir antikor kullanarak western blot ile analiz. Aktin için bir antikor özel yükleme kontrolü için kullanılmıştır. Şekil 2: HIF-1α aktivite. HRE lusiferaz 293 hücreleri hipoksi ve 48 saat için normoxia kültüre edildi değiştirilmiş ve daha sonra bir lusiferaz tahlil kiti ve luminometre kullanarak lusiferaz sinyali tespit etmek için parçalanmış. Sonuçlar göreli lüminesans birimi (RLU) olarak ifade edilir.