Denna artikel beskriver en<em> In vitro</em> Teknik för celler övervakning cancerceller invaderar genom ett monoskikt av endotelceller. Data förvärvas i realtid som en funktion av förändringar i impedans på ytan av elektroderna vid brunnen botten.
Metastatisk spridning av maligna celler kräver nedbrytningen av basalmembran, fastsättning av tumörceller till vaskulär endotel, indragning av endotelceller korsningar och slutligen invasion och migration av tumörceller genom endotelskiktet att komma in i blodomloppet som ett transportmedel till avlägsna platser i den mottagande 1-3. En gång i cirkulationssystemet, cancerceller följa kapillärväggarna och extravasera till den omgivande vävnaden för att bilda metastaser 4,5. De olika komponenterna i tumörcell-endotelcell interaktion kan replikeras in vitro genom att utmana ett monoskikt av humana navelvenendotelceller (HUVEC) med cancerceller. Studier utförda med elektron och faskontrastmikroskopi tyder på att in vitro händelseförloppet ganska representera in vivo metastaserande process 6. Här beskriver vi en elektrisk-impedans baserad teknik som övervakar och kvantifierar i realtid de invasjon av endotelceller från maligna tumörceller.
Giaever och Keese beskrivas först en teknik för att mäta variationer i impedansen när en population av celler växa på ytan av elektroderna 7,8. Den xCELLigence instrumentet tillverkas av Roche, använder en liknande teknik att mäta förändringar i elektrisk impedans som celler fästa och sprida sig i en odlingsskål täckt med ett guld mikroelektrod array som täcker cirka 80% av arean på botten av en brunn. Som celler fästa och spridas på elektrodytan, leder det till en ökning av elektrisk impedans 9-12. Impedansen visas som en dimensionslös kallas parameter cell-index, som är direkt proportionell mot den totala arealen av vävnad-kultur väl som täcks av celler. Således kan cell-index användas för att övervaka celladhesion, fördelning, morfologi och celltäthet.
Invasionen analys som beskrivs i denna artikel är baserad på förändringari elektrisk impedans vid elektroden / cell interfas, som en population av maligna celler invaderar genom en HUVEC monolager (Figur 1). Störningen av endotelceller korsningar, indragning av endotelceller cellslager och utbyte av tumörceller leda till stora förändringar i impedansen. Dessa förändringar direkt korrelerar med den invasiva kapacitet av tumörceller, dvs, invasion av mycket aggressiva celler leda till stora förändringar i cellernas impedans och vice versa. Denna teknik ger en tvåfaldig fördel jämfört med befintliga metoder för att mäta invasion, såsom Boyden-kammare och matrigel analyser: 1) endotelcell-tumörcell interaktion mer nära efterliknar in vivo processen, och 2) den data som erhålles i real- tid och är lättare att mäta, i motsats till slutpunkt analys för andra metoder.
Den realtid HUVEC invasionen analysen är en enkel, men kraftfull metod för övervakning av invasion. Det ger resultat i realtid, vilket är en avsevärd fördel jämfört med andra traditionella tekniker som är beroende av slutpunkten analys. Analysen kan modifieras för att testa läkemedel, antikroppar, ligander och proteiner som hämmare eller stimulatorer av metastasering. Effekten av olika agenter på endotel / cancercell överhörning kan bedömas också. Vid införande av exogena medel, såsom tillväxtfaktorer och droger i kulturen medier, är det viktigt att se till att de inte påverkar integriteten för HUVEC monolagret. Rubbning av HUVEC monolagret kan testas genom införande av det exogena medlet i frånvaro av invaderande celler, och se till att det inte sker någon förändring i cell index. Därför bör lämpliga kontroller ingå som en del av den experimentella designen.
Olika cellinjer visar olika cell-index kurvor som de bildar en confluent monolager. Formen på kurvan, liksom den maximala cell-index nås är celltypsspecifik. HUVEC celler visar en karakteristisk övergående flackare cell index 4-6 timmar efter sådd, följt av ytterligare stabilisering på en högre cell index efter 16-18 timmar. Därför är det viktigt att låta cellerna bildar ett sammanhängande monoskikt under minst 18 timmar före tillsatsen av tumörceller.
Eftersom cellen index är beroende på den joniska miljön vid elektroden / cell interfas, olika faktorer, såsom cell-morfologi och kvalitet på cell-cell adhesioner påverka cell-index, förutom området för brunnens botten täckt. Sålunda är minskningen i cell index, som sker vid tumörcell invasion, en funktion av flera faktorer, vilka innefattar tillbakadragning av endotelceller korsningar och efterföljande tumörcell invasion.
XCELLigence Instrumentet tillverkas i tre olika utföranden: realtid cell analysator(RTCA) SP, RTCA MP och RTCA DP. Den RTCA SP Instrumentet har en 96-väl E-platta medan RTCA MP instrumentet kan hålla upp till sex 96-håls E-plattor samtidigt. Detta möjliggör för high-throughput screening av läkemedel och föreningar. Experimenten i denna artikel utförs med RTCA DP instrumentet, som rymmer tre 16-well E-plattor. Varje E-plåthållaranordningen station kan självständigt drivs, vilket gör att flera användare att köra experiment samtidigt. Den RTCA DP Instrumentet kan också användas för att studera migrering med CIM-plattor. Dessa är 16-brunnars plattor med övre och undre kammare åtskilda av ett polyetylentereftalat (PET)-membran med en median porstorlek av 8um. De elektroniska sensorerna är placerade på undersidan av det porösa membranet av den övre kammaren. Den nedre kammaren fungerar som en reservoar för chemoattractant för celler i den övre kammaren. Dock är en stor fördel med HUVEC invasionen analysen över CIM-plattor som tumörcellsinvasion i fd Is begränsas inte av porstorleken, såsom endotelceller invasion beror på överhörning mellan tumör och endotelceller.
Den HUVEC invasionsanalys kan också utföras på ECIS Z instrumentet, tillverkad av Applied Biophysics (Troy, NY). Den ECIS Z Instrumentet använder en teknik som liknar xCELLigence instrumentet, med skillnader i uppställningen och elektroden konfigurationer. Vi har framgångsrikt utfört HUVEC invasionen analyser med hjälp av 8-brunnars ECIS arrayer. Det är viktigt att notera att den väl bottenytan området är större i ECIS arrayer, vilket kräver ett större antal av endotel-och tumörceller som skall pläteras: 2,5 x 10 5 och 1 x 10 5 celler respektive.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick generöst stöd av medel från Barncancerfonden (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) och NIH (R01CA108641).
Vi vill tacka Dr Anton Wellstein och medlemmar av hans laboratorium för att dela sina erfarenheter och hjälpa oss att optimera metoder som presenteras.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
xCELLigence RTCA DP station | Roche | 05469759001 | |
RTCA control unit | Roche | 05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
E-Plate 16 | Roche | 05469830001 | |
HUVEC cells | Lonza | CC-2517 | |
EGM-2 media | Lonza | CC-3156 | |
EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-4176 | |
0.1% Gelatin in sterile H2O | Millipore | MCPROTO045 |