Eine Echtzeit-Elektrische Impedanz basierte Technik zur Invasion von Endothelzellen Monolayer von Krebs Zellen zu messen
Summary
Dieser Artikel beschreibt ein<em> In vitro</em> Verfahren zur Überwachung Krebszellen Invasion durch eine Monoschicht aus Endothelzellen. Die Daten werden in Echtzeit in Abhängigkeit von Änderungen der Impedanz auf der Oberfläche der Elektroden, die an der Unterseite auch erworben.
Abstract
Metastatischen Verbreitung von bösartigen Zellen erfordert Abbau Basalmembran Befestigung von Tumorzellen an Gefäßendothel, Einziehen der endothelialen Kreuzungen und schließlich Invasion und Migration von Tumorzellen durch das Endothel in die Blutbahn als Transportmittel geben zu entfernten Stellen in dem Host 1-3. Einmal in das Kreislaufsystem, sich Krebszellen Wände Kapillare und extravasieren des umliegenden Gewebes zu bilden Metastasen 4,5. Die verschiedenen Komponenten der Tumorzellen Endothelzellinteraktion kann in vitro durch die Herausforderung eine Monoschicht von menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) mit Krebszellen repliziert werden. Studien mit Elektronen-und Phasenkontrast-Mikroskopie durchgeführt vermuten, dass die in vitro Ablauf getreu die in vivo Metastasierungsprozess 6. Hier beschreiben wir eine elektrische Impedanz-basierte Technik, die quantifiziert und überwacht in Echtzeit den INVASion von Endothelzellen von malignen Tumorzellen.
Giaever und Keese zuerst beschrieben eine Technik zum Messen von Schwankungen in der Impedanz, wenn eine Population von Zellen auf der Oberfläche der Elektroden 7,8 wachsen. Die xCELLigence Instrument, hergestellt von Roche, verwendet eine ähnliche Technik, um Änderungen in der elektrischen Impedanz zu messen, wie Zellen befestigen und in eine Kulturschale mit einer Gold-Mikroelektroden-Anordnung, die etwa 80% der Fläche bedeckt auf dem Boden eines Wells bedeckt verbreiten. Als Zellen anlagern und ausbreiten auf der Elektrodenoberfläche, es führt zu einer Erhöhung in der elektrischen Impedanz 9-12. Die Impedanz wird als dimensionslose Parameter bezeichnet Zell-Index, der direkt proportional zu der Gesamtfläche von Gewebekulturen, die von Zellen bedeckt ist, angezeigt. Daher kann die Zell-Index verwendet werden, um die Zelladhäsion, Streichen, Morphologie und die Zelldichte zu überwachen.
Die Invasion Assay in diesem Artikel beschriebenen Änderungen auf der Grundlagein elektrische Impedanz an der Elektrode / Zelle Zwischenphase, als eine Population von bösartigen Zellen eindringen durch eine HUVEC Monolayer (Abbildung 1). Die Störung der endothelialen Kreuzungen, Rückzug der endothelialen Monolayer und Ersatz von Tumorzellen führen zu großen Veränderungen in der Impedanz. Diese Veränderungen korrelieren direkt mit der Kapazität von invasiven Tumorzellen, dh Invasion durch hoch aggressive Zellen zu großen Veränderungen in der Zelle Impedanz und umgekehrt führen. Diese Technik bietet einen zweifachen Vorteil gegenüber bestehenden Methoden zur Messung der Invasion, wie Boyden-Kammer und Matrigel-Tests: 1) die Endothelzellen-Tumor-Zell-Wechselwirkung mehr ahmt die in vivo-Verfahren, und 2) die Daten in Echtzeit erhalten Zeit und ist leicht zu quantifizieren, um Endpunktanalyse für andere Verfahren entgegen.
Protocol
Discussion
Die Echtzeit-HUVEC Invasion Assay ist eine einfache, aber leistungsfähige Methode zur Überwachung Invasion. Es liefert Ergebnisse in Echtzeit, was ein wesentlicher Vorteil gegenüber anderen herkömmlichen Techniken, die auf Endpunktanalyse verlassen. Der Assay kann auf Testverbindungen, Antikörper, Liganden und Proteine als Inhibitoren oder Stimulatoren der Metastasierung modifiziert werden. Die Wirkung verschiedener Mittel auf die endotheliale / Krebszelle cross-talk kann auch beurteilt werden. Bei der Einführung von exogener Mittel, wie Wachstumsfaktoren und Medikamenten in den Kulturmedien, ist es wichtig sicherzustellen, dass sie keinen Einfluss auf die Integrität der HUVEC Monoschicht. Die Unterbrechung der HUVEC Monoschicht durch Einführen der exogene Substanz in Abwesenheit von eindringenden Zellen, und sicherzustellen, dass es keine Veränderung in der Zelle Index geprüft werden. Daher sollten geeignete Kontrollen als Teil des experimentellen Designs enthalten sein.
Verschiedene Zelllinien zeigen unterschiedliche Zell-Index-Kurve, wie sie eine conf bildenluent Monoschicht. Die Form der Kurve, sowie die maximale Zell-Index erreicht ist Zelltyp-spezifisch. HUVEC-Zellen zeigen eine charakteristische transiente Abflachung der Zelle Index 4-6 Stunden nach dem Aussäen von einem anderen Stabilisierung bei einer höheren Zelle Index nach 16-18 Stunden. Daher ist es wichtig, damit die Zellen bilden eine konfluente Monoschicht für mindestens 18 Stunden vor der Zugabe von Tumorzellen.
Da die Zelle Index ist abhängig von der ionischen Umgebung an der Elektrode / Zelle Interphase Einfluss verschiedener Faktoren wie zum Beispiel Zell-Morphologie und die Qualität der Zell-Zell-Adhäsion der Zellen-Index, zusätzlich zu dem Bereich der Schachtboden bedeckt. Somit ist die Abnahme in der Zell-Index, der auf Tumorzellinvasion auftritt, eine Funktion verschiedener Faktoren, die das Zurückziehen der endothelialen Verbindungen und anschließende Tumorzellinvasion umfassen.
Das xCELLigence Instrument ist in drei verschiedenen Konfigurationen hergestellt: Echtzeit Zellanalysator(RTCA) SP, MP und RTCA RTCA DP. Die RTCA SP Instrument hält eine 96-well E-Platte, während die RTCA MP Instrument kann bis zu sechs 96-Loch-E-Platten gleichzeitig. Dies ermöglicht für das Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten und Verbindungen. Die Experimente in diesem Artikel werden unter Verwendung des RTCA DP Instrument, das drei 16-Well-Platten E-halten kann. Jede E-Platte Haltestation können unabhängig voneinander betrieben werden, was ermöglicht mehreren Benutzern die Experimente gleichzeitig laufen. Die RTCA DP Instrument kann auch verwendet werden, um die Migration mit CIM-Platten zu untersuchen. Dies sind 16-Well-Platten mit oberen und unteren Kammern durch eine Polyethylenterephthalat (PET)-Membran mit einer mittleren Porengröße von 8um getrennt. Die elektronischen Sensoren sind an der Unterseite der porösen Membran von der oberen Kammer angeordnet ist. Die untere Kammer als Reservoir für Lockstoff für Zellen in der oberen Kammer. Allerdings ist ein großer Vorteil der HUVEC Invasionsassay über die CIM-Platten, die die Tumorzelle Invasion in der ehemaligen is nicht durch die Porengröße beschränkt, wie Endothelzellen Invasion hängt von Übersprechen zwischen den Tumorzellen und Endothelzellen.
Die HUVEC Invasionsassay können auch auf ECIS Z Instrument durchgeführt werden, hergestellt von Applied Biophysik (Troy, NY). Die ECIS Z Instrument nutzt eine Technologie ähnlich dem xCELLigence Instrument, mit Unterschieden in der Array-und Elektroden-Konfigurationen. Wir haben erfolgreich HUVEC Invasionsassays mit den 8-well ECIS Arrays durchgeführt. Es ist wichtig zu beachten, dass die gut Bodenfläche größer in der ECIS Arrays, die eine größere Anzahl von Endothel und Tumorzellen erfordert plattiert werden soll: 2,5 x 10 5 und 1 x 10 5 Zellen sind.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus Kinder-Krebs-Stiftung (Baltimore, MD), Brandon Lee Carrington Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) und NIH (R01CA108641) unterstützt.
Wir möchten Dr. Anton Wellstein und Mitglieder seines Labors für den Austausch ihrer Erfahrungen und helfen uns, präsentiert Methoden optimieren danken.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| xCELLigence RTCA DP station | Roche | 05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche | 05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche | 05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | Millipore | MCPROTO045 |
Referenzen
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