Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

<p class="jove_title"> 1. Usul notlar</p><ul><li> Ksilen ve fenol toksik kimyasallar ve bir fumehood ele alınmalıdır. Kullanmadan önce madde güvenlik bilgileri formuna (MSDS) bakın.</li><li> Ksilen bazı plastik erir, bu bileşiklerin tolere polipropilen tüpler kullanılmalıdır.</li><li> Özel ipuçları, dahili bir kömür stoper içerdiğini satın alınabilir. Bu pipet herhangi bir kauçuk parçaları çözme ksilen önler. Alternatif olarak, filtre ipuçları kullanılabilir.</li></ul><p class="jove_title"> 2. Parafin kaldırma</p><ol><li> Fumehood 800 ul ksilen (VWR, CABDH6216-4), parafin çözmek için 5 ila 15 dakika hafif sallayarak bir rocker örnek ve yer içeren etiketli tüpe ekleyin.</li><li> Pelet, 3 dakika boyunca bir mikrosantrifüj maksimum hız (14.000 rpm veya 16 000 xg) iplik örnek. Dikkatlice ksilen süpernatantı çekilme ve ksilen atık atmak için bir polipropilen tüp atmayın. Pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun.</li><li> Ksilen yıkama adımları tekrarlayın ve 1 2until parafin tamamen çözülür. Bu doku örneği boyutuna bağlı olarak genellikle 2-3 yıkama gerektirir. Tamamen çözülmüş örnek yumuşak görünecek ve yapısal bütünlüğünü bazen kaybedersiniz. Örnek bütünlüğünü hafifçe bir pipet ucu ile tespit edilebilir.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Etanol rehidrasyon</p><ol><li>% 100 etanol (v / v) moleküler biyoloji notu etanol, vorteks 800 ul ekleyin, daha sonra mikrosantrifüj 14.000 rpm az 3 dakika boyunca dönerler. Pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, etanol süpernatantı.</li><li> 800 ul% 70 etanol (% 100 (v / v) distile su ile seyreltilmiş etanol (dH₂ O)), girdap ve 14.000 rpm'de 3 dakika spin. Dikkatlice etanol süpernatant kaldırmak.</li><li> 800 ul% 50 etanol (% 100 (v / v) distile su ile seyreltilmiş etanol (dH₂ O)), girdap ve 14.000 rpm'de 5 dakika spin. Pipetleme tarafından dikkatli bir şekilde, mümkün olduğu kadar etanol gibi çıkarın. Pelet rahatsız tam Rehidrate bir doku değil pelet yanı sıra kurutulmuş doku olarak bu noktada son derece dikkatli olun.</li><li>, 5 dakika etanol süpernatant, hava-kuru pelet kaldırarak sonra dikkatli üstü kuru değil.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Doku sindirim</p><ol><li> Lizis Tampon 200-500 ul (aşağıdaki formül) ekleyin. Pelet bir pipet veya vorteks kullanarak yeniden askıya aldı. Bu noktada Ekstra çaba doku tamamen yeniden askıya örnek daha eksiksiz bir sindirim ve DNA'nın daha iyi bir verim neden olacak.</li><li> 56 örnekleri inkübe ° C su banyosu veya ısıtma bloğu.</li><li> Doku çekirdeği, başak proteinaz K (20 mg / ml stok solüsyonu, Invitrogen, AM2548) sabah ve akşam 20 ul.</li><li> Doku tamamen eriyene kadar 2 ila 5 gün boyunca sindirim yukarıdaki adımları tekrarlayın.</li></ol><p class="jove_step"> Lizis Tampon</p<ul><li> 10 mM Tris-HCl pH: 8.0</li><li> 100 mM EDTA pH 8.0</li><li> 50 mM NaCl</li><li>% 0.5 SDS</li><li> 200 mg / ml proteinaz K (kullanmadan hemen önce ekleyin)</li></ul><p class="jove_title"> 5. DNA kadar temiz</p><ol><li> Fenol doymuş (Fisher, BP1750I-400) ve tersine çevirerek karıştırın eşit miktarda bir tampon ekleyin. Mikrosantrifüj içinde 14.000 devirde en az 5 dakika Spin.</li><li> Yeni bir tüp sulu katman aktarın. Interfaz Not: beyaz malzeme çok şey var?</li><liInterfaz (genellikle 3 veya daha fazla kez) netleşene kadar sulu fraksiyonu 1. ve 2. adımları tekrarlayın. Ekstraksiyon geri gerçekleştirin * interfaz nihai verimi artırmak için bulanık.</li><liÖrnek çıkartılan sulu kesir izoamil alkol (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400): kloroform: interfaz> sonra, eşit miktarda fenol ekleyin. 5 dakika karıştırın ve sonra 14.000 rpm'de 5 dakika döndürün. Artık daha fazla fenol ve sulu tabakanın çıkarılması kolaylaştırılması, interfaz keskinleştirir Thisreduces</li><li> 37 1 saat süreyle 100 mg / ml sulu katman yeni bir tüp çıkarın ve treatwith RNaz A ° C</li><li> Kalan RNaz A kaldırmak ve sulu fraksiyonu toplamak için 1. ve 4. adımları tekrarlayın. Daha ilk lizat kaldırmak için çok daha az protein olması gerektiği gibi sadece 1 veya 2 tampon doymuş fenol adımları gerekir gerekir.</li></ol><p class="jove_content"> * Ekstraksiyon dH 50-100 ul eklemek gerçekleştirmek için₂ 0 interfaz ve organik kısmını içeren numune tüpü. Karıştırın ve 5 dakika mikrosantrifüj 14.000 rpm'de örnek spin Tüpü ters çevirin. Sulu faz toplayın ve daha önceden edinilmiş sulu çıkarma ekleyin. Interfaz netleşene kadar ekstraksiyon tekrar devam edin.</p><p class="jove_title"> 6. DNA yağış</p><ol><li> Toplanan sulu tabakanın hacmini tahmin edin.</li><li> 1 / 10 hacim 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve% 100 izopropanol (v / v) moleküler biyoloji notu (veya% 100 etanol 2.5 cilt) 1 hacim ekleyin.</li><li> İyice karıştırın ve 30 dakika veya gece için buz üzerinde veya -20 ° C derin dondurucuya koymak.</li><li4> Spin maksimum hızda (14.000 rpm) ° C 10 dakika için mikrosantrifüj</li><li> Süpernatantı atın.</li><li>% 70 buz soğuk etanol istenmeyen tuzları kaldırmak için pelet yıkayın.</li><li> Tercih tampon yeniden askıya pelet (genellikle dH₂ O).</li></ol><p class="jove_title"> 7. DNA sayısallaması</p><ol><li> DNA konsantrasyonu ölçmek. A260 A280 oranı ~ 1,8 olmalıdır. Küçük miktarda DNA, NanoDrop spektrofotometre kullanarak ölçüm tercih edilmektedir.</li><li> Takiben nicelik, jel elektroforezi örnek DNA kalitesini test ve kirlenmesine neden olan RNA tamamen bozulmuş olup olmadığını belirlemek için yapılmalıdır.</li><li> Yüksek kalite edilen DNA downstream uygulamalar için uygundur, ya da daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de saklanabilir. RNA hala örnek varsa, DNA kadar temiz ve yağış adımları yineleyin ve yeniden miktarını ve kalitesini örneklerinin hak.</li></ol>