DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen
Summary
Dieses Video zeigt das Protokoll für die DNA-Extraktion aus Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten Material. Dies ist eine mehrtägige Prozedur, in der Gewebeschnitte werden deparaffinierten mit Xylol, rehydriert mit Ethanol und mit Proteinase K zu reinigen und zu isolieren DNA für die nachfolgende Gen-spezifischen oder genomweite Analyse.
Abstract
Disease Entwicklung und Progression sind durch häufige genetische und epigenetische Aberrationen einschließlich chromosomalen Umlagerungen Kopienzahl Gewinne und Verluste und DNA-Methylierung gekennzeichnet. Advances in High-Throughput-, Genom-weiten Profiling-Technologien, wie zB Microarrays, haben deutlich unsere Fähigkeit zur Identifizierung und Erkennung dieser spezifischen Veränderungen verbessert. Doch die Technik zu verbessern fortsetzt, bleibt ein limitierender Faktor Probe Qualität und Verfügbarkeit. Darüber hinaus Follow-up der klinischen Informations-und Krankheitsverlauf sind oft Jahre nach der ersten Probenentnahme gesammelt. Die Proben werden typischerweise Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE), in Krankenhaus-Archiven für Jahre bis Jahrzehnte gespeichert. DNA effizient und effektiv von in Paraffin eingebetteten Proben gewonnen werden, wenn die entsprechende Methode der Extraktion angewendet wird. Hochwertige DNA aus ordnungsgemäß konserviert und gelagert Proben extrahiert werden können quantitative Tests für Vergleiche von gesunden und kranken Geweben und Generierung von genetischen und epigenetischen Signaturen 1 zu unterstützen. So extrahieren DNA aus Paraffin eingebettete Proben, Gewebe-Kerne oder mikrodissezierten Gewebe sind Xylol Behandlung, die das Paraffin aus dem Gewebe löst unterzogen und anschließend rehydriert mit einer Reihe von Ethanol wäscht. Proteine und schädliche Enzyme, wie Nukleasen werden anschließend durch Proteinase K. Die Zugabe von Lysepuffer, die Denaturierungsmittel wie Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, erleichtert die Verdauung 2 verdaut. Nukleinsäuren sind aus dem Gewebe Lysat unter Verwendung von Puffer-gesättigtem Phenol und Hochgeschwindigkeitszentrifugation die eine biphasische Lösung generiert gereinigt. DNA und RNA bleiben in der oberen wässrigen Phase, während Proteine, Lipide und Polysaccharide in der inter-und organisch-Phasen jeweils beschlagnahmt. Retention der wässrigen Phase und wiederholte Phenolextraktionen erzeugt eine saubere Probe. Nach Phenolextraktionen ist RNase A aufgenommen, um kontaminierende RNA zu eliminieren. Zusätzliche Phenolextraktionen nach Inkubation mit RNase A verwendet werden, um alle verbleibenden Enzym zu entfernen. Der Zusatz von Natriumacetat und Isopropanol fällt DNA und Hochgeschwindigkeitszentrifugation ist Pellet der DNA eingesetzt und erleichtern Isopropanol entfernen. Überschüssige Salze über aus Fällung mit nachfolgender enzymatischer Assays stören, kann aber aus der DNA durch Waschen mit 70% Ethanol, gefolgt von Zentrifugation, um re-Pellet der DNA 3 entfernt werden. DNA wird in destilliertem Wasser oder der Puffer der Wahl erneut suspendiert, quantifiziert und bei -20 ° C. Gereinigte DNA kann anschließend in nachgelagerten Anwendungen, die auch verwendet werden, sind aber nicht beschränkt auf, PCR, array komparative genomische Hybridisierung 4 (Array-CGH), methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP) und Sequenzierung, so dass für eine integrative Analyse der Gewebe / Tumorproben.
Protocol
Discussion
Biopsiert oder chirurgisch exzidiert Gewebe für histologische Analyse und Diagnose sind oft Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten (FFPE) für die langfristige Lagerung. Mit dem wachsenden Interesse für das Verständnis der genetischen Grundlagen von Krankheiten, stellt die Fähigkeit, DNA aus diesen Proben extrahiert eine unschätzbare Quelle für diagnostische Material, das für die genomische Analyse und translationale Studien verwendet werden können. Historisch FFPE-Proben wurden als nicht gangbar Quelle für die molekulare Analyse von Nukleinsäuren kann stark von Protein-Nukleinsäure-und Protein-Protein-Quervernetzung 6 geändert werden. Ermöglicht jedoch die Entdeckung, dass Proteaseverdau fragmentierten Nukleinsäuren, die für Downstream-Analysen, einschließlich PCR, Array-CGH, Sequenzierung und Methylierung Profilierung sind frei, die Nutzung dieser wertvollen Proben für genetische Analyse 6..
DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebetteten Gewebe ist ein robustes Verfahren, das auf unterschiedliche Löslichkeit der DNA zu reinigen beruht. Die extrahierte DNA Qualität und Quantität und der Erfolg der anschließenden DNA-Amplifikation ist abhängig von einer Reihe von Parametern vor, während und nach der Extraktion. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Art und Menge des Gewebes, auf die Art der Fixativ für Gewebe Konservierung verwendet, die Dauer der Fixierung, Alter der Paraffinblock-und Lagerbedingungen sowie die Länge der gewünschten DNA-Segment werden verstärkt 1,7. Entfernung von Paraffin aus dem Gewebe ist der wichtigste Schritt für eine erfolgreiche Extraktion als ungelöst Paraffin führt zu einer schlechten Qualität der Proben und der Hemmung der PCR-Amplifikation.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten die Mitglieder des Lam-Labor für die Bewertung und Kritik an diesem Video und Artikel danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus der Canadian Institutes for Health Research unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Xylene | VWR | CABDH6216- 4 | – |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | – |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet | C0160-B | – |
| Lysis Buffer | – | – | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher | BP1750I-400 | – |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher | BP1752I-400 | – |
| RNase A | Roche | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | – | – | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | – | – |
Referenzen
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of ‘masked’ proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. o. s. e. p. h., R, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
