وتقدم تكنولوجيا الكشف ampliPHOX اللونية كبديل غير مكلف للكشف عن ميكروأرس مضان. استنادا بلمرة ضوئية المنشأ ، ampliPHOX تنتج البقع البوليمر الصلبة مرئية للعين المجردة في دقائق معدودة. ثم يتم تصوير النتائج وتفسيرها تلقائيا مع حزمة برامج بسيطة لكنها قوية.
ظهرت ميكروأرس الحمض النووي كأداة قوية للكشف عن العوامل المسببة للأمراض. 1-5 وعلى سبيل المثال ، أثبتت العديد من الأمثلة على القدرة على نوع وسلالة فيروس الانفلونزا. 6-11 تحديد وتصنيف الفرعي لأنفلونزا على ميكروأرس الحمض النووي وتطبيقاتها في القطاعين العام الصحة وعيادة للكشف المبكر والتدخل السريع ، والتقليل من تأثير وباء الأنفلونزا. مضان التقليدية في الوقت الراهن الكشف ميكروأري الأكثر استخداما الأسلوب. لكن ، وكما استخدموا تكنولوجيا متطورة تقدم نحو الاستخدام السريري (1) ، واستبدال الأجهزة غالية مع انخفاض تكلفة تكنولوجيا الكشف واظهار خصائص الأداء مماثلة لمضان جعل المقايسات ميكروأري أكثر جاذبية وفعالة من حيث التكلفة.
المقصود من الكشف اللونية ampliPHOX التكنولوجيا لتطبيقات البحوث ، ووضع حد للكشف داخل احدة من حيث الحجم من 11 مضان التقليدية ، مع الميزة الرئيسية التي يجري تقريبي عشرة أضعاف تكلفة أقل مقارنة صك الماسحات الضوئية اللازمة لميكروأري مبائر ميكروأري مضان الكشف. ميزة أخرى هي من الحجم الصغير الصك الذي يسمح لقابلية ومرونة ، على عكس مضان الصكوك التقليدية. لأن التكنولوجيا البلمرة ليست كما الخطية بطبيعتها كما كشف مضان ، ومع ذلك ، هو الأنسب لانخفاض الكثافة ميكروأري التطبيقات التي المطلوب هو نعم / لا جواب عن وجود تسلسل معين ، مثل الكشف عن صفائف الممرض. في الوقت الحاضر كثافة بقعة أقصى متوافقة مع الكشف ampliPHOX هو ~ 1800 البقع / الصفيف. بسبب محدودية كثافة البقعة ، ميكروأرس العالي الكثافة ليست مناسبة للكشف عن ampliPHOX.
هنا ، نقدم ampliPHOX تكنولوجيا الكشف اللونية كوسيلة لتضخيم إشارة على ميكروأري منخفض الكثافة وضعت لكشف وتشخيص فيروسات الأنفلونزا (FluChip). على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم FluChip (أ ميكروأري الحمض النووي) ، وتطبيق واحد محدد للكشف ampliPHOX ، أي دمج ميكروأري الهدف biotinylated يمكن الكشف عن وصفت بطريقة مماثلة. تصميم وميكروأري biotinylation هدف ليتم القبض هي من مسؤولية المستخدم. مرة واحدة وقد تم القبض على الهدف biotinylated على الصفيف ، يمكن إجراء الكشف عن طريق وضع علامات ampliPHOX لأول مرة مع مجموعة المتقارن streptavidin التسمية (ampliTAG). عند التعرض للضوء باستخدام أداة قارئ ampliPHOX ، البلمرة حل مونومر (ampliPHY) يحدث فقط في المناطق التي تحتوي على ampliTAG المسمى الأهداف. ويمكن تشكيل البوليمر الملون في وقت لاحق مع حل غير سامة لتحسين النقيض البصرية ، تليها التصوير والتحليل باستخدام مجموعة من البرامج البسيطة (ampliVIEW). ويمكن إجراء فحص كامل من FluChip الامم المتحدة واستخراج عينة لينتج حوالي 6 ساعات ، ويمكن الانتهاء من الخطوات المذكورة أعلاه الكشف ampliPHOX في حوالي 30 دقيقة.
كشف اللونية ampliPHOX التكنولوجيا المقدمة هنا هي سريعة ، رخيصة بديلة للكشف لون واحد مضان لانخفاض الكثافة ميكروأري التطبيقات. أظهرت تخطيطي في الشكل 1 ، ويستند على مبدأ الكشف عن استخدام تسمية photoinitiator (1B). في وجود حل مونومر المحتوية على (1C) ، والتعرض للضوء يسبب photoinitia…
The authors have nothing to disclose.
InDevR يقر المعاهد الوطنية للصحة / NIAID U01AI070276 وR43AI077112 لتمويل هذا العمل.
Reagent/equipment | Manufacturer | Catalog # | Comments |
---|---|---|---|
Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
FluChip primer mix | InDevR | N/A | not yet available for sale |
Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |