Summary

ampliPHOX比色法检测为流感的DNA芯片

Published: June 09, 2011
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Summary

ampliPHOX比色法检测技术是作为一种廉价的替代芯片荧光检测。 ampliPHOX聚合的基础上,产生的固体聚合物点,在短短几分钟内肉眼可见。结果将被自动成像和解释一个简单但功能强大的软件包。

Abstract

DNA芯片已成为一个病原体检测的有力工具。1-5例如,已被证明的能力类型和亚型流感病毒的例子很多。6-11识别和亚型流感DNA芯片应用在公共健康和诊所,以便及早发现,迅速介入,并最大限度地减少流感大流行的影响。传统的荧光是目前最常用的基因芯片检测方法。然而,由于基因芯片技术对临床使用过程,取代昂贵的仪器,成本低的检测技术表现出相似的性能特点,荧光将使芯片检测更具吸引力和成本效益。

ampliPHOX比色法检测技术是用于研究中的应用,和传统荧光11的幅度内之一为了一个近似的10倍仪器成本较低的优势,比焦荧光微阵列芯片扫描仪需要与主要的检测限,检测。另一个优点是体积小巧,仪器的可移植性和灵活性允许不同于传统的荧光仪器。因为聚合技术是不是天生荧光检测线性的,但是,它是最好的适合密度较低的芯片应用中存在一定的顺序是/没有答案所需,如病原体检测阵列。目前最大的现货密度与ampliPHOX检测兼容〜1800点/阵列。由于现场密度的限制,高密​​度微阵列不适合ampliPHOX检测。

在这里,我们目前作为一个信号放大方法对流感病毒的检测和表征(流感集成电路芯片)开发的低密度芯片ampliPHOX比色法检测技术。虽然这个协议使用一个特定的应用程序,任何芯片,结合生物素化的目标,可以标记,并以类似的方式检测ampliPHOX检测流感集成电路芯片(DNA芯片)。被捕获的芯片设计和生物素化的目标是用户的责任。一旦阵列上已捕获生物素化的目标,ampliPHOX检测可以进行与链霉亲和标签的共轭(ampliTAG)的数组,第一个标记。 (ampliPHY)使用ampliPHOX读者仪器,聚合单体溶液的光曝光后只发生在含有ampliTAG标记的目标地区。聚合物形成一种无毒的解决方案,以改善视觉对比度,成像和使用的一个简单的软件程序包(ampliVIEW)分析,随后可沾上。从整个联合国提取样本流感集成电路芯片检测结果可在约6个小时,和上面所述的ampliPHOX检测步骤,可以在大约30分钟完成。

Protocol

1。用RT – PCR样品扩增提取病毒RNA的临床物质或病毒隔离QIAcube全自动核酸提取平台一起使用Qiagen公司MinElute病毒自旋套件。拔牙是200μL标本与最终洗脱体积60μL。商店提取物在-70 ° C或较低,以供日后使用。 在模板中自由区,准备上冰的RT – PCR扩增预混,根据制造商的协议。在RT – PCR技术结合生物素,使用制造商提供的dNTP混合液进行生物素化的dNTP混合物。使用生物素化的dNTP混合物的?…

Discussion

这里介绍ampliPHOX比色法检测技术是一种快速,廉价的替代单一的颜色,密度更低的芯片应用荧光检测。示意图如图1所示,检测原理的基础上使用了光引发剂的标签(1B) 。含有一种单体溶液(1C)的存在,光线照射引起的光引发剂(ampliTAG),只有在标示的地区引发的聚合反应(1D)。虽然表现为流感的识别和亚型的DNA阵列,该技术可以扩展到检测到任何一个芯片上捕获生物素化的产?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

InDevR承认NIH / NIAID的U01AI070276和R43AI077112为这项工作提供资金。

Materials

Reagent/equipment Manufacturer Catalog # Comments
Qiagen MinElute Virus Spin Kit Qiagen 57704 single 60 μl elution
QIAcube Qiagen 9001292 optional
ABI 9800 Fast Thermal Cycler Applied Biosystems 4441166  
Qiagen OneStep RT-PCR kit Qiagen 210210 kit dNTPs not used
2x Spotting Buffer InDevR Inc. MI-5007  
Biotinylated dNTP Mix InDevR Inc. MI-5009  
Lambda exonuclease Epicentre Biotechnologies LE032K 2500 U, 10U/μl
FluChip primer mix InDevR N/A not yet available for sale
Orbital Shaker Madell Technology ZD-9556-A  
Wash Bins InDevR Inc. MI-4002  
Wash Racks InDevR Inc. MI-4003  
2x Hybridization Buffer InDevR Inc. MI-5004  
Calibration Chips InDevR Inc. AP-5006  
Wash Buffers A-D InDevR Inc. MI-5005  
ampliRED InDevR Inc. AP-5004  
ampliTAG InDevR Inc. AP-5001  
2x ampliTAG Buffer InDevR Inc. AP-5002  
ampliPHY, ampliPHY enhancer InDevR Inc. AP-5003  

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Moulton, K. R., Taylor, A. W., Rowlen, K. L., Dawson, E. D. ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza. J. Vis. Exp. (52), e2682, doi:10.3791/2682 (2011).

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