Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel
Summary
Eine formale Demonstration der Zerlegung einer Maus Auge, was zu einem ganzen Berg der retinalen Pigmentepithels.
Abstract
Das retinale Pigmentepithel (RPE) liegt an der Rückseite des Säugetier-Auge, gerade unter der neuralen Netzhaut, die Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen) enthält. Das RPE ist eine Monoschicht von pigmentierten kubischen Zellen und Mitarbeiter eng mit der neuronalen Retina knapp darüber. Dieser Verein macht die RPE von großem Interesse für Forscher untersuchen Netzhauterkrankungen. Das RPE ist auch der Ort einer in vivo-Assay von Homologie-directed DNA-Reparatur, die p un-Assay. Die Maus Auge ist besonders schwer zu sezieren aufgrund seiner geringen Größe (ca. 3,5 mm im Durchmesser) und seine Kugelform. Dieser Artikel zeigt im Detail ein Verfahren für die Präparation des Auges führt einen ganzen Berg der RPE. In diesem Verfahren zeigen wir, wie man mit und nicht gegen die kugelförmige Struktur des Auges zu arbeiten. Kurz gesagt, sind das Bindegewebe, Muskeln und Sehnerv aus dem hinteren Teil des Auges entfernt. Dann werden die Hornhaut und die Linse entfernt. Als nächstes sind strategische Schnitte, die zu erheblichen Abflachung der übrigen Gewebe. Schließlich ist der neuronalen Retina vorsichtig abgehoben, enthüllt eine intakte RPE, die noch auf die zugrunde liegende Ader-und Lederhaut befestigt wird. Das ganze Berg kann die p un-Assay oder für die Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz Beurteilung des RPE Gewebe durchzuführen.
Protocol
Discussion
Das RPE ist die Website des p un-Assay, einem In-vivo-Assay von Homologie-directed reparieren. Die p un-Assay wurde verwendet, um die Auswirkungen der verschiedenen DNA-Schäden 1,2 und DNA-Schäden Signal-und Reparatur-Gene 3,4,5 über die Häufigkeit von Homologie-directed Reparatur zu studieren. Dieser Test ist sehr empfindlich, Aufdeckung Single-Cell-Veranstaltungen auf der RPE 1. Es kann auch erkennen, Unterschiede im Timing der Homol…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Environmental Health Sciences unterstützt [K22ES012264 zu AJRB] und einem American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173 bis 04] Pilot projectaward [zum AJRB]. Wir danken auch Mitglieder der Bishop-Labor für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Kommentare auf der Video-und Adam Brown insbesondere für das Beispiel von dem, was nicht zu tun. Wir danken Dr. Donald McEwen von Greehey Kinder-Krebs-Forschung für die Erlaubnis der Verwendung seiner Binokular / Video-Kamera Set-up für die Dreharbeiten der Dissektion Video. Wir bedanken uns bei Daron Brown in Corte Instruments zum Schärfen und Reparatur unserer Mikrodissektion Werkzeuge.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| straight forceps | Roboz | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX | |
| 45° forceps | Roboz | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX | |
| 15° “up” forceps | Roboz | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX | |
| spring scissors | Roboz | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel | |
| binocular dissecting microscope | Ziess | Discovery V.8 | use reflected light source | |
| phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
Referenzen
- Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice. Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).
- Reliene, R. H. l. a. v. a. c. o. v. e., Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice. Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).
- Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice. Cancer Res. 60, 395-399 (2000).
- Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion. J. Nucleic Acids. , (2010).
- Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo. Nucleic Acids Res. , (2010).
- Bishop, A. J. p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development. Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).
- Bodenstein, L., Sidman, R. L. Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity. Dev Biol. 121, 192-204 (1987).
- Burke, J. M. Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?. Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).
