Heterokaryon Техника для анализа типа клеток конкретных Локализация

1. Трансфекции клеточных линий Трансфекция Способ 1 (Lonza Nucleofection для повышения эффективности первичной трансфекции клеток) Клетки должны быть последнего прохода и в логарифмической фазе роста до трансфекции. Вымойте клеток в phophate солевом буфере (PBS) и урожай клеток трипсинизации. Сбор клетки центрифугированием при 1500 мкг в течение 5 минут. Добавить стерилизовать скользит корки до 6-луночный планшет. Покровные стекла могут быть покрыты для улучшения адгезии клеток. Место 1,5 мл питательной среды (в данном случае средний Дульбеко изменение Орла (DMEM), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)) в каждую лунку и равновесие СМИ в инкубаторе. Урожай клеток трипсинизации и ресуспендируют в минимальном объеме фосфатным буферным раствором (PBS). Граф клеток и центрифуги правильное количество ресуспендирования обеспечить ~ 5×10 5 клеток на пробу. Ресуспендируют клетки тщательно в 100 мкл комнатной температуре Nucleofector раствора на образце. Комбинат по 100 мкл клеточной суспензии с 5 мкг плазмидной ДНК и передачи образца Nucleofector кювет стараясь не включают воздушные пузыри. Выберите соответствующий Nucleofector программы (для этого может потребоваться предыдущего тестирования установить оптимальную эффективность трансфекции с минимальными смертность). Вставьте кювету клеток / ДНК суспензии в Nucleofector Держатель кювет и начать выбранной программы. После завершения удаления кюветы и добавить ~ 500 мкл предварительно уравновешенную питательных сред на него (взяты из 6-луночный планшет). Сразу передачи образца в 6-луночный планшет с конечного объема 1,5 мл на лунку. Клетки должны быть покрыты либо смешанным населением или по отдельности, для элементов управления. Трансфекция Способ 2 (Qiagen Effectene трансфекции для клеточных линий) Подготовка трансфекции комплексов с использованием реагентов Qiagen Effectene добавьте сначала 0,8 мкг каждого образца ДНК плазмиды до 200 мкл буфера ЕС. Добавить 6,4 мкл реагента усилитель для каждого образца, смешать кратко, щелкая трубки, и инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре. Добавьте 20 мкл Effectene реагент для каждого образца, перемешать, щелкая трубки и инкубировать 15 минут при комнатной температуре. Во время этой инкубации подготовить двух клеточных линий, представляющих интерес для трансфекции. Вымойте недавно пассировать клетки (<80% слияния) один раз в фосфатным буферным раствором (PBS). Плюс 1,5 мл свежей нагревается и уравновешенной ростовой среды (в данном случае Дульбеко изменение Орла среды (DMEM), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)). После трансфекции комплексы инкубируют в течение 15 минут, передача 1,2 мл средств массовой информации для каждого образца. Смешать с помощью пипетки, и немедленно передать ~ 700 мкл комплексов для каждой из двух скважин в 6-луночный планшет. Добавить по каплям, и перемешать, осторожно, вращая тарелку. Разрешить клетки для трансфекции, по крайней мере за 3 часа (может меняться в зависимости от типа клеток). Добавить стерилизовать скользит корки до новой 6-луночный планшет. Покровные стекла могут быть покрыты для улучшения адгезии клеток. После трансфекции клетки, клетки мыть два раза PBS и урожай клеток минимальна trysinization, добавив примерно 100 мкл раствора трипсина в каждую лунку, кратко агитацию пластина полностью пальто каждую лунку и сразу аспирационных от трипсина. Как только клетки подняли, добавить 1,5 мл свежей информации. На данный момент, камеры должны быть покрыты в любом смешанных или отдельных групп населения (для контроля) на стерильную скользит крышку. Разрешить клетки для восстановления в течение 12 часов. 2. Сотовые Fusion Удалить культуру средств массовой информации из клетки и мыть дважды с PBS. На данный момент, рекомендуется для лечения клеток с циклогексимид (100 мкг / мл) для ингибирования синтеза белка. Разрешить клетки инкубировать в течение 2 часов и затем промыть клетки в два раза с PBS. Предохранитель клетки, подвергая их решения 50% полиэтиленгликоля 1000 (ПЭГ 1000) в бессывороточной DMEM за 125 секунд при комнатной температуре. Вымойте клеток с PBS, чтобы удалить раствор PEG 1000, и добавьте 2 мл свежей нагревается и уравновешенных средств массовой информации. Разрешить клетки инкубировать в течение 18 – 24 часов. Флуоресцентной микроскопии Удалить культуру средств массовой информации, и промыть клетки дважды в PBS. Fix клетки, добавляя 1 мл 4% параформальдегида решения (в PBS) в каждую лунку. Аккуратно агитировать за 15 минут. Вымойте фиксированной клетки дважды в PBS. Аккуратно снимите крышку ускользает из пластины, фитиль лишнюю PBS. Обратить на предметные стекла загружаются с одной каплей монтажа средний (90% глицерина, 100 мм Трис рН 7,5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo октановым числом), содержащий DAPI (4 ',6-diamidino-2-фенилиндола). Удалите излишки монтажа среды из слайдов и печать сотрудничестваверсии скользит с лаком для ногтей. Визуализация клеток с помощью конфокальной микроскопии или epifluorescence. 3. Представитель Результаты На рисунке 2 показан пример heterokaryon эксперимент с использованием первичных фибробластов и H1299 немелкоклеточного клетки карциномы легких. Белок в данном эксперименте (Куриное анемия вирусов VP3) отображает в первую очередь цитоплазматической локализации в первичных типов клеток и ядерной локализации в трансформированных клеточных типов, как визуализируется epifluorescence микроскопии. Белка выражается в слиянии либо GFP (pEGFP-N1 вектор, Clontech) в первичных фибробластов крайней плоти (PFF) или DsRed (DsRed-N1 вектор, Clontech) в H1299 клеток. Контрольные образцы с участием самостоятельно слияния (два верхних строк) дисплей многоядерные клетки, не изменяя при стационарных моделей локализации. Такие изменения в противном случае может произойти из-за чувствительности к слиянию условий или образование syncitia. Heterokaryon слияния (нижний ряд) демонстрируют ядерную вступления GFP-плавленого первичная ячейка происхождения белка и колокализации с DsRed, слившихся белков в ответ на введение трансформированной клетки материала. Пример, показанный является относительно редким heterokaryon слияние в результате только две клетки, один из каждого типа, о чем свидетельствует присутствие обоих fluoroprotein сигналов. В дополнение к выявлению этих типов локализации переходы, nucleocytoplasmic челночные деятельность может быть легко обнаружены наличие одного флуорофора в обоих ядер. Этот тип определения ясно при рассмотрении 1:01 слияния клеток и будет зависеть от ингибированием трансляции. Рисунок 1. Блок-схема heterokaryon метод с использованием первичных фибробластов и H1299 немелкоклеточным раком клетки. Интересующего гена клонируется производить в рамке слияние с одним из двух флуоресцентных генов белка. Клеточные линии, затем кратковременно трансфицированных либо построить и позволил восстановить. Heterokaryon формирования индуцированных краткое лечение полиэтиленгликоля (ПЭГ), а затем дальнейшей инкубации. Наконец, субклеточные локализации белка интереса наблюдается с использованием различных форм флуоресцентного микроскопа. Рисунок 2. Nucleocytoplasmic торговли людьми и челночные активность вируса куриного белка Анемия VP3 визуализированы путем слияния heterokaryon. Верхний ряд: Представитель изображения собственного плавленого H1299 клеток, экспрессирующих DsRed-VP3 Ближний ряд:.. Представитель epifluorescence образы первичных клеток фибробластов крайней плоти (PFF), выражающая GFP-VP3 после слияния PEG Нижний ряд: Heterokaryon слияние PFF и H1299 клеток. Желтый указывает колокализации GFP и DsRed сигналов. Клетки были обследованы использовании Leica AF6000E флуоресцентного микроскопа Leica и обработки изображений.