Protocolo que describe la aplicación de un sistema de celda de flujo para el cultivo y el análisis de biofilms microbianos para microscopía de escaneo láser confocal (CLSM).
Muchas células microbianas tienen la capacidad de formar comunidades de microorganismos sésiles define como biofilms que han alterado las propiedades fisiológicas y patológicas en comparación con los microorganismos de vida libre. Biofilms en la naturaleza son a menudo difíciles de investigar y residen en condiciones de poca definida 1. El uso de un sustrato transparente, es posible que un sistema en el dispositivo de biofilms simple puede ser examinado en una forma no destructiva en tiempo real: aquí se demuestra el montaje y operación de un sistema de flujo modelo de celular, para los estudios in vitro en 3D de biopelículas microbianas generando una alta reproducibilidad bajo condiciones bien definidas 2,3.
El sistema consta de una celda de flujo que sirve como cámara de crecimiento de la biopelícula. La celda de flujo se suministra con nutrientes y oxígeno a partir de un frasco de medio a través de una bomba peristáltica y medio gastado se recoge en un recipiente de residuos. Esta construcción del sistema de flujo permite un suministro continuo de nutrientes y la administración de antibióticos por ejemplo, con la mínima perturbación de las células cultivadas en la cámara de flujo. Por otra parte, las condiciones de flujo dentro de la celda de flujo permiten estudios de biofilm expuestos a esfuerzos cortantes. Una burbuja de captura confines dispositivo de burbujas de aire de la tubería que podrían alterar la estructura del biofilm en la celda de flujo.
El sistema de celda de flujo es compatible con microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) y por lo tanto puede proporcionar información en 3D muy detallado sobre el desarrollo de biopelículas microbianas. Las células en el biofilm pueden ser etiquetados con sondas fluorescentes o proteínas compatible con el análisis de CLSM. Esto permite la visualización en línea y permite la investigación de nichos en el biofilm en desarrollo. Interrelación microbiana, la investigación de agentes antimicrobianos o la expresión de genes específicos, son muchas de las configuraciones experimentales que se pueden investigar en el sistema de celda de flujo.
Hemos demostrado un sistema de celda de flujo que representa una poderosa herramienta en las investigaciones de biofilm. Combinado con imágenes en 3D mediante microscopía confocal, el sistema tiene una serie de ventajas en comparación con otros métodos de análisis de biopelículas microbianas mediante técnicas microscópicas más tradicionales. Este sistema permite la visualización en 3D de las comunidades microbianas que viven biofilm sin alteración de la comunidad. Microscopía de luz no se proporcione información detallada sobre los nichos de la biopelícula y al mismo tiempo proporciona una resolución de la microscopía electrónica a nanoescala de la biopelícula, que no permite imágenes de células vivas.
Utilizando el sistema de flujo de canal descrito anteriormente hemos dilucidado la distribución espacial de las células bacterianas sensibles a varios antibióticos 5-8 (Figura 4a), la distribución de los compuestos extracelulares, por ejemplo, ADN y 11.9, la distribución de células móviles y no móviles de la misma especie dentro de una comunidad bacteriana 4,6,9 (Figura 4c). Tenemos la visión de que el sistema de celda de flujo se pueden utilizar para estudiar los aspectos de las biopelículas de levadura. Esta puede ser la distribución espacio temporal de biofilm de la levadura en respuesta a factores ambientales, tales como fungicidas, así como la identificación de genes implicados en el desarrollo de la levadura biofilm. A pesar de la levadura no se sabe a diferenciarse en células móviles y no móviles, otros aspectos de la diversificación de biofilm pueden ser los estudios tales como el cambio morfológico de la levadura a las células pseudohyphal y el cambio de haploides a las células diploides.
Hemos mostrado un sistema que cumple con varias especies de microbios, y trabajará con varias técnicas de tinción. Una gran variedad de sondas de coloración diferente y las proteínas fluorescentes, tales como las buenas prácticas agrarias, facilitar la investigación específica de nicho en el biofilm en desarrollo y es una herramienta eficaz para analizar el efecto de los agentes antimicrobianos u otros factores ambientales. La información que se puede obtener es muy detallado (Figura 4) y las características del biofilm pueden ser cuantificados con los programas de ordenador como COMSTAT 12,13.
En general, el aspecto más importante del protocolo es el hecho de que se trata de un proceso que consume tiempo. También es una limitación que las células deben ser capaces de crecer en un no-fluorescente, la superficie transparente. . Dado que la formación de biopelículas se analiza con un microscopio confocal, la profundidad que puede ser investigado se limita a unos pocos cientos de micrómetros 14 Hay más limitaciones técnicas inherentes en el diseño: el sistema no es adecuado para el cribado de alto rendimiento, como un investigador experimentado puede manejar más de 15 canales por experimento, que a su vez puede tomar varios días para prepararse. Sin embargo, los antibióticos o los mutantes que se consideran relevantes para los estudios de bio-película puede ser inicialmente masa tamizada con otros métodos como la tinción de cristal violeta antes de que los candidatos más interesantes son transferidos al sistema de celda de flujo. Las hojas de cristal de la cubierta son muy finas y se rompen con facilidad, y se debe tener cuidado al manipular los sistemas. Además los tubos deben ser examinados todos los días durante la ejecución de un experimento, como considerable "back-crecimiento" en los tubos de entrada justo antes de la células de flujo puede ocurrir. Tal contaminación puede ser resuelto mediante la eliminación de varios centímetros de tubo de silicona del lado de la entrada de las células de flujo, utilizando una técnica estéril.
Figura 4 a) cuatro días PAO1 de edad -. Biofilm las buenas prácticas agrarias tratadas durante 24 horas con colistina y yoduro de propidio para la tinción de muertos (mancha roja) b) presentación en 3D de un día de tres años de edad P. aeruginosa PAO1 (tipo salvaje P. aeruginosa) – GFP biofilm 6 c) presentación de imágenes 3D de una PAO1 – PPC pila mutante (azul) con un tipo de YFP PAO1 silvestres (amarillo) d) 5 días de edad PAO1 – GFP biofilm presenta como un 3D e imagen) 26 h S. cerevisiae (PTR3 mutante en CEN.PK fondo) biofilm teñidas con SYTO-9 15.
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |