B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon
Summary
Bir gen yapısı ve fonksiyonu analizi verimli bir sistem<em> Ex vivo</em> Dalak B-lenfositleri kültür açıklanmıştır. Bu yöntem, bir yardımcı, ecotrophic ambalaj hücre hattı rekombinant retroviral üretim yararlanır. Kararlı, yüzey antikorların üretimi için önde gelen sınıf anahtarı rekombinasyon geçiren B hücreleri elde edilir birincil lenfositler içinde ilgi çekici bir gen ekspresyonu kalıtsal.
Abstract
Ökaryotik hücrelerde genlerin transgenik ifade ilgi bir gen ortaya çıkan fenotip analizi kolaylaştırmak için heterolog ifade sisteminin kontrolü altında ifade edildiği güçlü bir ters genetik bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım, normal organizmada bulunan bir gen ifade etmek için bir gen ürünü bir mutant formu ifade etmek, ya da gen ürünü bir dominant-negatif bir form içinde ifade etmek için kullanılabilir. Transkripsiyonel yönetmelik 2-4 yorumlanan B hücreleri 1, gelişimi ve farklılaşmasında önemli bir kontrol mekanizması hematopoetik sistem, çalışmaya yararlıdır.
Fare genetik, insan genlerini ve hastalıkların çalışma için güçlü bir araçtır. Fare ve insan genomu karşılaştırmalı bir analiz genom 5 üzerinden% 90 synteny korunması ortaya koymaktadır. Ayrıca, fare modellerinde kullanılan teknoloji, örneğin, gen kesintileri ve alel değiştirme 6 insan genlerinin çalışma için geçerli Ancak, transgenik fare yaratma, hem de mali ve teknik nitelikte kaynakların büyük bir anlaşma gerektirir . Fare suşlarının knock out kütüphaneleri (Komp, EUCOMM, NorCOMM) veya büyük ölçekli çabaları ve işbirliği 7 gerektiren mutagenez indüklenen suşları (RIKEN), derlemek için çeşitli projeler başladı. Bu nedenle, ilk önce bir fare modeli ilerleyen önce birincil hücrelerinin bir hücre kültürü modelinde istenen bir genin fenotipi çalışma arzu edilir.
Retroviral DNA istikrarlı, tercihen içinde veya transkripsiyon birimleri veya CpG adaları yakınında, konak DNA'sına entegre ve transkripsiyonel susturulması 8 9 kaçınarak faiz paketlenmiş gen ekspresyonu kalıtsal. Genler sonra, transkripsiyon ve protein üretimini yüksek verimlilik, yüksek verimlilik retroviral organizatörü kontrolü altında kopyalanır. Bu nedenle, retroviral ifade transfect için zor hücreleri kullanılan hücrelerin mitoz sırasında aktif bir devlet olabilir. Virüs yapısal genler ambalaj hücre hattı içinde yer olduğundan, ilgi gen klonu için kullanılan ifade vektörler viral revertants olasılığını ortadan kaldırır ve viral süpernatantlar ile çalışma güvenliğini artırır, virüs yapısal genleri içeren bulaşıcı virionlar 10 üretilmektedir.
Burada rekombinant retroviral üretim ve dalak B hücreleri sonraki enfeksiyon için bir protokol mevcut. Izolasyondan sonra, kültürlü Th elde edilen lenfokinler ve B hücre çoğalması ve farklılaşması 11 bir patlama neden olur anti-CD40, dalak hücreleri ile uyarılır . Bu protokol, dalak plasmasitik farklılaşma ikna etmek için değil, antijenik stimülasyon önce ilk hematopoetik olaylar aşağıdaki B hücreleri izole olarak, geç B hücre gelişimi ve farklılaşmasında meydana gelen olayların çalışma için idealdir.
Protocol
Discussion
Şekil 1 burada tarif ve tasvir olarak dalak B hücreleri retroviral transdüksiyon lymphopoesis gelişimsel olayların birçok transkripsiyonel Kural 1, 2 kontrol edilir çünkü, B-lenfositleri çalışma yararlı genetik bir yaklaşımdır . CD40L üzerinden tetikleme B hücre olgunlaşması, daha sonraki aşamalarında, B hücre büyüme indüksiyon, hücre döngüsü içine giriş ve çoğalması 11, 20 için gereklidir . Şekil 2'de görüldüğü gibi, B…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CK, Columbia Üniversitesi Yüksek Lisans programı tarafından desteklenmektedir. UB Amerika Lösemi ve Lenfoma Derneği, Yeni Araştırmacı Ödülü Lösemi Araştırma Vakfı alıcı üyesidir ve Columbia Üniversitesi New Fakültesi başlangıç fonu tarafından destekleniyor.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| RPMI | Invitrogen/Gibco | 22400 | ||
| PBS | Invitrogen/Gibco | 20012 | ||
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | ||
| CD43 beads | Miltenyi | |||
| B Cell Complete Media | Various components | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol | |
| IL-4 | ||||
| Anti-CD40 | BD Pharmigen | 553787 | ||
| polybrene | Sigma Aldrich | 107689 | ||
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma Aldrich | C6628 | Used at 100mM | |
| Phoenix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | ||
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | ||
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Pharmigen | A85-1 |
Referenzen
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. . Introduction to Genetic Analysis. , (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
